Как можно восстановить аксоны

Функциональное восстановление ЦНС после повреждений ограничено неспособностью нейронов и аксонов к регенерации. При этом аксоны периферической нервной системы (ПНС) регенерируют достаточно хорошо и полно, аксоны ЦНС — в минимальной степени [1—3]. Необратимая дегенерация аксонов нейронов головного и спинного мозга — ведущая причина неизлечимости тяжелых повреждений ЦНС, а также нейродегенеративных заболеваний.

Дегенерация аксонов является анатомической основой патогенеза многих заболеваний ЦНС и ПНС, с ней связан неврологический дефицит, а его регресс — с возможностью регенерации осевых цилиндров. Вторичная демиелинизация развивается как типовая реакция на повреждение нервной ткани и способствует углублению аксонального повреждения. Демиелинизированные аксоны еще хуже проводят нервный импульс, т. е. вторичная демиелинизация ухудшает течение аксонопатии и способствует углублению неврологического дефицита. Однако миелин ЦНС и ПНС различен: в ЦНС это продукт клеток олигодендроглии, в ПНС — шванновских. Различаются и регенераторные возможности: если периферические нервы относительно быстро и полно регенерируют, то проводящие пути ЦНС (например, кортикоспинальные тракты) восстанавливаются медленно и неполно. Одна из причин этого — наличие в ЦНС ингибиторов аксонального роста, связанных с миелином, глией и межклеточным матриксом. Молекулы-ингибиторы аксонального роста играют важную роль в эмбриогенезе и развитии ЦНС млекопитающих, но у взрослых препятствуют регенерации аксонов. В настоящее время молекулы-ингибиторы аксонального роста являются объектом углубленного изучения, разрабатываются лекарственные препараты, нейтрализующие эти влияния.

Известно, что неспособностью к регенерации обладают только аксоны ЦНС взрослых высших млекопитающих, у более примитивных животных, а также на ранних стадиях онтогенеза у плодов эта способность сохранена [2, 4, 5]. Хорошей нейропластичностью после повреждений и заболеваний ЦНС обладают дети, причем тем лучшей, чем в более раннем возрасте получено данное повреждение. Потеря способности аксонов ЦНС к регенерации совпадает по времени с дифференцировкой клеток глии [2, 5]. Непосредственное окружение нейронов и аксонов (олигодендро- и астроцитарная глия, а также миелин) содержат молекулы-ингибиторы роста аксонов, к которым относятся миелинассоциированные ингибиторы роста аксонов [6] и сульфатированные сахара экстрацеллюлярного матрикса [7].

Настоящий обзор посвящен ингибиторам роста аксонов в ЦНС, их роли в норме и при различных видах патологии.

Аксональная регенерация в ЦНС ограничена множеством ингибиторных молекул, связанных с глией и миелином. Эти ингибиторы стимулируют внутриклеточный сигнальный Rho-механизм — единый путь торможения регенерации аксонов в ЦНС, «запускаемый» повреждениями аксонов и глии [8, 9]. Все ингибиторные молекулы действуют именно через этот механизм.

RhoA — малая ГТФаза, активированная форма которой представляет собой серин/тирозинпротеинкиназу (RhoA-киназа, ROCK). Rho-ROCK-механизм связан с такими функциями нейронов, как миграция, рост дендритов и аксонов, нейропластичность, причем оказывает на них именно тормозящее действие. Этот механизм играет важную роль в патогенезе повреждений спинного и головного мозга, а также нейродегенеративных заболеваний [8—10].

В последние годы проясняется физиологическая роль Rho-ROCK [11], связанная с локомоциями клеток. Локомоция клеток осуществляется посредством псевдоподиальной активности и представляет собой координированный циклический процесс, включающий выпячивание (протрузия) псевдоподий на переднем крае клетки, их прикрепление к внеклеточному матриксу, центростремительное натяжение прикрепившихся псевдоподий, освобождение от контактов с матриксом задней (хвостовая) части клетки. Движущаяся клетка приобретает «локомоторный фенотип»: она сильно поляризована, ее передняя часть имеет вид широкой и тонкой пластинки, по краю которой непрерывно образуются псевдоподии, противоположная часть клетки ретрактирована. Образование псевдоподий обусловлено полимеризацией актиновых микрофиламентов на концах, обращенных к плазматической мембране клетки, наращивание которых создает толкающую силу, «выпячивающую» участок мембраны в виде широкой ламеллоподии или нитевидной филоподии. Важную роль в локомоции клеток выполняют также микротрубочки, по ним к псевдоподии транспортируются вещества, необходимые для роста актиновых микрофиламентов, они также способствуют «разбору» слишком увеличившихся в размерах фокальных контактов, что позволяет мигрирующим клеткам ликвидировать старые участки прикрепления [12].

Для передвижения клеток необходимо воздействие специфических цитокинов — факторов роста и связывания интегриновых рецепторов с внеклеточным матриксом. Передача сигналов от рецепторов факторов роста и интегринов контролирует не только пролиферацию клеток, но и их локомоцию, поэтому многие факторы роста являются митогенами-мотогенами. К митогенам-мотогенам относятся тромбоцитарный и эпидермальный факторы роста (PDGF и EGF), фактор роста фибробластов (FGF), «рассеивающий» фактор (scatter factor, HGF/SF) и др. Связывание митогенов-мотогенов со своими рецепторами включает как митогенную Ras-Raf-МАР-киназную сигнальную цепь, так и «морфогеную» сигнальную цепь от активированного Ras, в которой сигнал передается через фосфатидилинозит-3-киназу (PI3K) на группу белков, играющих ключевую роль в контроле над организацией и динамикой цитоскелетных систем, актиновых микрофиламентов и микротрубочек. Это G-белки, или малые ГТФазы, семейства Rho, действующие как молекулярные «двусторонние переключатели», попеременно то переходя в активное состояние при связывании с ГТФ, то теряя активность в результате гидролиза ГТФ до ГДФ. В активном состоянии G-белки семейства Rho участвуют в передаче сигналов от рецепторов факторов роста и интегриновых. Активация малых ГТФаз стимулирует сборку актиновых микрофиламентов, усиливает их контрактильность, способствует формированию стресс-фибрилл и связанных с ними фокальных контактов (белок Rho), стимулирует полимеризацию актина на плюс-концах разветвляющихся микрофиламентов, что создает толкающую силу, формирующую ламеллоподию (белок Racl) [12—14].

Таким образом, суперсемейство малых ГТФаз является одним из ключевых регуляторов множества сигнальных путей у эукариот [15]. К нему относится и семейство Rho ГТФаз, играющих важную роль в эмбриогенезе и регенерации ЦНС. К настоящему времени в семействе Rho насчитывают 20 белков, разделяемых на восемь подсемейств. Rho ГТФазы участвуют в различных физио- и патологических процессах — эмбрио-, митогенезе, росте и дифференцировке клеток, фокальных контактах регенерации, контракции. Соответственно высока клиническая важность изучения Rho ГТФазы — с их функционированием связаны гипертонус гладких и скелетных мышц (при артериальной и хронической легочной гипертензии, вариантной стенокардии, глаукоме и др.), нарушения клеточной дифференцировки (при новообразованиях), проблемы регенерации клеток (в частности, при повреждениях нервной ткани и нейродегенеративных заболеваниях) [16, 17]. При повреждениях ЦНС и нейродегенерациях активация RhoA и ROCK является ключевым элементом прекращения роста аксонов, тормозит элонгацию конуса аксона, блокирует спратинг нейритов [18]. Экспериментально доказано [19], что химическая блокада Rho-ROCK-механизма меняет ингибиторные эффекты ROCK in vitro и способствует аксональной регенерации in vivo.

Рост аксонов осуществляется конусами роста — расширениями терминалей нервных волокон. Их ультраструктура отличается очень высокой концентрацией ряда органелл (микротрубочки, микрофиламенты, митохондрии, гранулярный ретикулум, лизо- и рибосомы), включает многочисленные вакуоли, что является показателем активного пиноцитоза экзогенных белков. Направление роста аксонов определяется процессом узнавания, который реализуется посредством избирательного адгезивного взаимодействия между конусами роста и окружающим их субстратом. Узнавание обеспечивают молекулы адгезии, которые встроены в плазмолемму ламелло- и филоподий и взаимодействуют с комплементарными молекулами во внеклеточном матриксе. Рост аксонов происходит по градиенту концентрации специфических химических факторов, вырабатываемых в органах-мишенях. Соответственно рост аксонов направляется и регулируется в том числе молекулами экстрацеллюлярного матрикса [19].

В 1985 г. М. Schwab и Н. Thoenen [20] изучали различия в процессах восстановления: культивировали симпатические и сенсорные нейроны в обогащенной ростовыми факторами среде и регистрировали рост отростков нейритов. Они зафиксировали рост волокон седалищного (принадлежат ПНС), но не зрительного (относятся к ЦНС) нерва. Авторы предположили, что в ЦНС содержатся ингибиторные молекулы, тормозящие регенерацию аксонов. М. Schwab и D. Bartholdi [21] продолжили поиски молекул, ингибирующих рост аксонов в ЦНС, учитывая, что наиболее ярким отличием повреждений ЦНС от ПНС является активация астро- и олигодендроцитов с формированием глиального рубца, в состав которого входят потенциально ингибиторные молекулы (например, NG2-хондроитин-сульфат-протеогликан).

В 1988 г. Р. Caroni и М. Schwab [22] обнаружили ген Nogo, продуктом которого является белок, ингибирующий регенерацию аксонов. Белок Nogo существует в трех изоформах, но только Nogo-A, экспрессируемый олигодендроцитами, связан с миелином ЦНС. Nogo-A имеет молекулярную массу 220—250 кД, является нормальным компонентом миелина олигодендроцитов и играет в норме ведущую роль в направлении аксонального роста в процессе онтогенеза и подавлении нейропластичности. Структурно-функциональные особенности Nogo-A включают два ингибиторных домена: N-терминальный, отсутствующий у изоформ Nogo-B и -C, и 66-аминокислотный конец (Nogo-66), присутствующий у всех трех изоформ. Оба этих сегмента белка Nogo-A потенциально могут участвовать в ингибировании аксонального роста, но Nogo-66 работает именно при повреждении миелина и олигодендроцитов [21, 23—25]. У нокаутных по Nogo-A мышей одни авторы [26] обнаружили «драматический» эффект регенерации аксонов, однако другие [27, 28] — не выявили подобного эффекта. Это заставило предполагать, что Nogo-A является не единственным ингибитором роста аксонов.

В дополнение к Nogo-A были выделены еще два миелинассоциированных ингибитора роста аксонов — миелинассоциированный гликопротеин (myelin-associated glycoprotein — MAG) и олигодендроцит-миелиновый гликопротеин (oligodendrocyte-myelin glycoprotein — OMgp). MAG был выделен в 1994 г. независимо в лабораториях M. Filbin и L. McKerracher [29—31]; он очень активно ингибирует рост аксонов in vitro, но нокаутные по MAG мыши также не показывают значимый регенерации аксонов [32—34].

Важным моментом в понимании механизмов регенерации аксонов стало обнаружение рецептора Nogo-66 (NgR) А. Fournier и соавт. [35, 36]. NgR располагается на поверхности аксонов, дополнительно поддерживается трансмембранными белками, например трансмембранный протеин p75 является рецептором для семейства нейротрофинов и специфически взаимодействует с NgR [23, 34, 35]. NgR, p75 и Lingo-1 (еще один трансмембранный протеин) формируют рецепторный комплекс для ингибиторной активности компонентов миелина. Три основные связанные с миелином молекулы, ингибирующие рост аксонов (Nogo-A, MAG и ОМ гликопротеины), действуют через этот рецепторный комплекс [32—34]. Его сигнальный эффект активирует малую ГТФазу Rho (через Nogo-66 рецептор NgR и трансмембранные рецепторы нейротрофинов). Через этот рецепторный комплекс миелинассоциированные протеины, другие ингибиторные молекулы экстрацеллюлярного матрикса и сам компактный миелин стимулируют экспрессию генов, вызывают активацию MAP-киназы и ROCK [36]. Результатом является влияние на цитоскелет аксона и торможение роста аксонального конуса [6, 11].

В дальнейшем, помимо миелинассоциированных протеинов, были идентифицированы и другие ингибиторные молекулы экстрацеллюлярного матрикса, обладающие свойством ограничивать рост нейритов: эфрины, семафорины, протеогликаны и др. [34]. На торможение роста аксонов и элонгацию аксонального конуса влияют и сам миелин, и сульфатированные сахара — хондроитин- и кератансульфатные протеогликаны [6]. Остатки миелина и протеогликаны являются основными компонентами глиальных рубцов [7, 18]. Их биологическое действие также осуществляется через Rho-ROCK-сигнальный путь.

Роль миелинассоциированных ингибиторов роста аксонов в патологии, особенно при травмах и повреждениях спинного мозга, изучена в многочисленных экспериментальных исследованиях — на культурах клеток и животных моделях. Физиологическая роль миелинассоциированных протеинов и Rho-ROCK-сигнального пути только начинает проясняться. Ингибиторы регенерации в ЦНС регулируют развитие миелина, электрическую и механическую стабильность аксонов, способствуют организации нейронных сетей, лимитируют синаптические контакты [11]. Миелинассоциированные ингибиторы также ограничивают обусловленную опытом пластичность, спраутинг нейритов и установление новых межнейронных связей в здоровой взрослой ЦНС, т. е. ограничивают анатомические изменения в ЦНС в норме и патологии, что делает их ведущими в фундаментальных исследованиях нейропластичности [8]. Нарушение функции миелинассоциированных ингибиторов связано с проблемами развития мозга, нейропсихиатрическими расстройствами, нейропатической болью [6, 11, 37].

Миелин обеспечивает быстрое и точное проведение нервного импульса по длинным аксонам, осуществляет метаболическую поддержку аксонов и обладает нейропротективными свойствами [38]. Недавние исследования [39, 40] показывают, что существуют механизмы регуляции активности нейронов, влияющие на степень миелинизации ЦНС. Предполагают, что адаптивная миелинизация является еще недостаточно изученной формой зависимой от активности пластичности нервной системы.

В процессе развития молекулы окружения аксонов участвуют в образовании сложных нейронных сетей. После своего образования нейронные сети «настраиваются» в течение короткого периода повышенной пластичности («критический период»), по окончании которого приобретают зрелую форму. Синаптические контакты в зрелом мозге стабильны в течение длительного времени, но имеет место и ограниченное структурное ремоделирование, что формирует клеточную основу обучения, памяти и нейропластичности [41]. Зависящая от активности модификация синаптических контактов может быть достигнута посредством динамической регуляции окружения аксонов. Ингибиторы регенерации ЦНС укрепляют нейронную архитектуру в конце критических периодов [42, 43]. Так, получены доказательства [44] вовлечения Nogo-A в ограничение нейрональной пластичности в зрительной системе грызунов. Важная физиологическая функция ингибиторов регенерации ЦНС заключается в консолидации нейронной архитектуры, созданной в конце критического периода.

Ингибиторы регенерации ЦНС экспрессируются глией и нейронами. Nogo-A, OMgp, NgR1-рецептор для Nogo-66, хондроитинсульфатные протеогликаны присутствуют в пре- и постсинаптических фракциях, выделенных из гиппокампа [29, 42, 45]. Ингибиторы регенерации ЦНС влияют на структуру и плотность синапсов [46]. В гиппокампе нокаутных мышей NgR1-дендритные шипы имеют менее зрелый профиль распределения, чем у мышей «дикого» типа, по-видимому, NgR1 необходим для правильного развития зрелых шипов [47]. Исследования показали, что потеря всех трех членов семейства NgR (NgR1, NgR2 и NgR3) увеличивает синаптическую плотность в молодом гиппокампе, указывая на то, что NgR функционируют как отрицательные регуляторы синаптогенеза. В недавних исследованиях[6] показано, что NgR1 является ключевой молекулой для ограничения ветвления дендритов в соматосенсорной коре взрослых мышей и пирамидальных нейронах гиппокампа.

Взаимодействие между ингибиторами регенерации ЦНС и факторами роста (например, BDNF) обеспечивает нейрональную пластичность и стабильность нейронных сетей после завершения критических периодов [45]. Многие нейропсихиатрические расстройства связаны с дефектами структуры или функции синапсов и могут быть вызваны сдвигом в возбуждающем/ингибиторном балансе. Учитывая, что ингибиторы регенерации ЦНС играют важную роль в регуляции этих процессов, их измененная экспрессия может способствовать развитию нарушений в работе мозга. В старческом мозге экспрессия в гиппокампе нескольких ингибиторов регенерации ЦНС увеличивается и коррелирует с дефицитом пространственного обучения и памяти, что показано в экспериментах на трансгенных животных [48, 49]. При этом крысы с пониженной экспрессией Nogo-A демонстрируют нарушения в социальном поведении [50]. Интересно, что мутации в NgR1 и Nogo-A у человека связаны с шизофренией [51].

Наиболее изучена роль миелинассоциированных ингибиторов роста и Rho-ROCK-механизма при спинальных повреждениях. Эффективность лечения этой патологии невелика. В недавнем обзоре P. Stahel и соавт. [52] перечислены все существующие терапевтические подходы: применение стероидов в острейшем периоде и стабилизация повреждений позвоночника в ближайшие 24 ч после травмы помогают ограничить вторичные повреждения; поддержание жизненно важных функций (дыхание, артериальное давление, борьба с кровопотерей) в острейшем и остром периодах и как можно более ранняя мобилизация пациента также позволяют предотвратить осложнения. Однако наибольшую надежду в плане именно восстановления неврологического дефицита сейчас возлагают на экспериментальные препараты, блокирующие молекулы — ингибиторы роста аксонов [52].

Аксональную регенерацию после спинальных травм блокируют окружающие место повреждения ткани. Аксональные контакты и восстановление в ЦНС блокируют остатки миелина, нейровоспаление и клеточная гибель в месте повреждения. Хондроитинсульфатные протеогликаны экстрацеллюлярного матрикса образуют глиальный рубец и периневральный барьер для аксонального роста и спрутинга [53—55]. Соответственно спонтанное восстановление после спинальной травмы, небольшие степени которого все же наблюдаются в клинике и эксперименте, зависит от присутствия миелинассоциированных протеинов-ингибиторов роста, воспалительного компонента в поврежденной нервной ткани, гиперактивации сигнального Rho-пути [56].

На экспериментальных животных моделях было показано [57, 58], что после селективного пересечения волокон кортикоспинального тракта на среднем грудном уровне терапевтическое введение антител против ингибиторного протеина Nogo-A способствует более быстрому и полному восстановлению двигательных функций, при этом отдаленная регенерация поврежденных аксонов отмечена только после Nogo-нейтрализации. Также после двустороннего пересечения кортикоспинального тракта в присутствии Nogo-A-нейтрализующих антител было показано увеличение коллатералей руброспинального тракта, иннервирующих шейный отдел спинного мозга, что коррелировало с клиническим улучшением и демонстрировало возможность для параллельных, анатомически обособленных систем по меньшей мере частично компенсировать повреждение другой системы [58].

В экспериментальных работах показана значимая роль в данной патологии миелинассоциированного протеина Nogo-A [56], липидов миелина [54], хондроитинсульфатных протеогликанов [53]. На культурах клеток в среде, лишенной этих молекул, аксонотомированные нейроны демонстрировали элонгацию аксонального конуса, животные нокаутных по генам миелинассоциированных протеинов линий лучше восстанавливались после экспериментальных спинальных повреждений. В экспериментах обнаружены динамические изменения экспрессии гена и синтеза Nogo-A после повреждения спинного мозга (низкая через 24 ч после травмы, продолжает понижаться далее до 3 дней, затем быстро повышается до пика около 7 дней, и постепенно снова снижается после 14 дней) [59], а также роль относительно сохранных надсегментарных проводников при спонтанном восстановлении у нокаутных по Rho-ROCK животных — имеет значение сохранность руброфугальных и руброспинальных путей с образованием de novo связей между красным ядром и ядром шва [56]. Эти данные очень важны для реабилитации пациентов со спинальными повреждениями, но наибольший интерес вызывают препараты — блокаторы ингибиторных молекул.

Компонент аксональной дегенерации очень важен в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. Сами зрелые нейроны практически не способны к регенерации (за исключением отдельных зон ЦНС), но аксоны обладают способностью к спраутингу и элонгации. На развернутых стадиях большинства нейродегенеративных заболеваний потеря тел нейронов всегда сопровождается потерей аксонов и нарушением способности к нейропластичности. Проблеме соотношения между дегенерацией тел нейронов и аксонов посвящен один из недавних обзоров, показавший, что молекулярные механизмы дегенерации аксонов различны с таковыми для тел нейронов, что делает воздействия на аксональный компонент нейродегенерации одним из возможных терапевтических подходов к данной патологии [60].

Гиперактивация Rho-ROCK-механизма описана при болезни Паркинсона, боковом амиотрофическом склерозе, спинальных амиотрофиях [60—64]. Особенно много внимания исследователей в последнее время привлечено к роли микроглиального окружения в дегенерации нейронов ЦНС. Важная роль астро- и микроглии и активации глиальной ROCK показана при боковом амиотрофическом склерозе [64] и болезни Паркинсона [62], особенно серьезное нейротоксическое и провоспалительное действие оказывает глиальное окружение нейронов на поздних стадиях нейродегенераций. Показано также [61], что активация ROCK усиливает присущую нейродегенеративным заболеваниям абнормальную белковую агрегацию (например, α-синуклеин при болезни Паркинсона), а препараты — ингибиторы ROCK могут ее понижать.

Гиперактивация Rho-ROCK-сигнального пути под воздействием миелинассоциированных ингибиторов влияет и на восстановление после инсульта [65, 66]. Миелинассоциированные протеины — ингибиторы роста аксонов синтезируются также некоторыми субпопуляциями клеток сетчатки и оказывают влияние на восстановление после повреждений зрительных нервов [67].

Учитывая значительную роль Rho-ROCK-сигнального пути и «миелинассоциированных ингибиторов в торможении регенерации аксонов ЦНС, в последние годы велик интерес исследователей к поиску потенциальных терапевтических агентов — веществ, блокирующих Rho-ROCK-механизм и усиливающих нейропротекцию и стимуляцию регенерации. Особое значение приобретает поиск таких потенциальных лекарств для пациентов со спинальными повреждениями и нейродегенеративными заболеваниями.

В настоящее время выделен класс веществ — ингибиторов RhoA (C3-exoenzmye, fasudil, Y-27632, ibuprofen, siRhoA, p21), активно изучаемых в экспериментах на клеточных культурах и моделях животных [8, 9, 53, 55, 68, 69]. Ингибиторы RhoA селективно блокируют ее без влияния на другие ГТФ (С3-трансферазы), к веществам этой группы относится, например, активно сейчас изучаемый (проходит I/IIa фазы клинических испытаний) cethrin [55, 68]. Существуют и другие химические агенты, селективно «связывающие» RhoA, например collapsing response mediator protein 4 (CRMP4), образующий комплекс CRMP4b/RhoA и блокирующий тормозящий эффект на рост аксонов; блокируют Rho-ROCK-механизм и антагонисты АТФ-рецепторов P2Y12 и P2Y13 [37].

Исследования на животных показывают терапевтическую эффективность ингибиторов RhoA. Большинство подобных испытаний проведено на моделях спинальной травмы. Так, в одном из недавних исследований [9] 120 крыс разделили на три группы: 40 — ложно оперированные (только ламинэктомия, без рассечения спинного мозга), 40 — ламинэктомия и спинальная, получение физиологического раствора, 40 — ламинэктомия и спинальная транссекция, введение лекарства. Показано достоверно лучшее восстановление у животных, получавших fasudil (по шкале Basso—Beattie—Bresnahan), а также достоверное снижение экспрессии RhoA мРНК в ткани спинного мозга животных опытной группы. Выявлены положительное влияние ингибитора RhoA Y-27632 на элонгацию аксонального конуса в обогащенной протеогликанами среде [18] и регресс неврологического дефицита у перенесших рассечение спинного мозга на уровне С_IV—С_V позвонков крыс [8], положительное влияние ингибиторов АТФ-рецепторов P2Y12 и P2Y13 на нейропатическую боль при спинальных повреждениях [37].

Тем не менее в большинстве экспериментальных исследований на животных с ингибиторами RhoA не доказана их эффективность. В недавнем крупном метаанализе [69] изучалась эффективность различных PhoA/ROCK-ингибиторов на моделях животных повреждения спинного мозга (геми-, транссекция, контузия). Работы, опубликованные в базах PubMed, EMBASE, Web of Science и соответствующие критериям включения (экспериментальная спинальная торакальная травма, лечение ингибиторами PhoA/ROCK, оценка двигательного восстановления по протоколам Basso, Beattie, and Bresnahan score или Basso Mouse Scale for Locomotion), оценивались двумя независимыми исследователями по девяти пунктам. Метаанализ включил 30 работ (всего 725 животных) и обнаружил эффективность ингибиторов PhoA/ROCK в 15% случаев. В некоторых работах, сообщавших об эффективности ингибиторов PhoA/ROCK, было обнаружено нарушение методологии; эти данные не включались в окончательный анализ.

Ингибиторы PhoA/ROCK (facudil) показали свою эффективность на моделях церебрального инсульта и нейродегенеративных заболеваний [61, 66]. Так, ингибитор RhoA facudil изучался на мышиной СОД1-модели бокового амиотрофического склероза (линия G93A), где вызывал торможение дегенерации мотонейронов и замедление прогрессирования заболевания. Препарат предотвращал гибель мотонейронов у G93A мышей, подавлял нарастание ROCK-активности, редуцировал фосфорилирование актина, индуцированное СОД1. В другом исследовании in vivo [63] у G93A-мышей при пероральном приеме facudil также удлинялись сроки выживания и улучшались двигательные функции, а применение facudil in vitro увеличивало выживаемость поврежденных мотонейронов. Facudil исследовался и на модели болезни Паркинсона, показав положительное влияние на выживаемость нейронов черной субстанции и даже уменьшение патологической агрегации α-синуклеина [61].

С целью возможного терапевтического влияния на рост и регенерацию аксонов изучали антагонисты к рецептору Nogo-66 (NgR1) [70], ингибитор гликозилирования хондроитинсульфатных протеогликанов PTPσ [53], моноклональные антитела против миелинассоциированных протеинов-ингибиторов аксонального роста. В недавнем исследовании [65] эффект моноклонального антитела GSK249320 против миелинассоциированного гликопротеина (MAG) показан на модели кортикального ишемического инсульта: у приматов, получавших GSK249320, к 16-му дню заболевания функциональное восстановление было достоверно лучше, чем в контрольной группе. Важно, что функциональное преимущество опытной группы было получено не за счет периинфарктной области и прилегающей премоторной зоны, что было продемонстрировано нейрофизиологическим — картированием двигательных зон (представительство вентральной премоторной зоны в экспериментальной группе было меньше, чем в контроле).

Таким образом, ингибиторную активность миелина ЦНС можно нейтрализовать с помощью антител к миелинассоциированным протеинам (например, анти Nogo-A), делеции генов Nogo, MAG и OMgp, введения растворимых NgR-фрагментов и NgR-блокирующих пептидов, торможения поступления кальция во внутриклеточное пространство, использования высоких концентраций цАМФ, применения ингибиторов RhoA или ROCK [71]. In vivo показаны нейтрализующий эффект моноклональных IgM-антител к Nogo (IN-1), умеренно выраженное, но достоверное улучшение восстановления после спинального повреждения у нокаутных по Nogo-A мышей, эффективность пептидов, взаимодействующих с активным 66-аминокислотным С-концом Nogo (например, NEP1−40), связывающихся с Nogo, но не активирующих его. Активно изучаются и нейтрализующие эффекты вторичных мессенджеров ингибиторной активности миелина: инактивирующих Rho-энзимов (например, С3-трансфераза), ингибиторов ROCR (например, Y27632,), эффекты нейтрализации активности Nogo и MAG продемонстрированы при инфузии in vivo аналогов цАМФ, а также медиатора p75 [71—73]. Представленный подход к управлению регенерацией аксонов кажется физиологически обоснованным и потенциально эффективным, однако решение данной проблемы далеко от завершения, необходимы дальнейшие исследования.

В заключение еще раз отметим, что ингибиторы регенерации ЦНС, работающие через Rho-ROCK-сигнальный путь, играют важную физиологическую роль не только в развитии ЦНС, но и по окончании критических периодов — в стабилизации нейронных сетей, ограничении ветвления дендиритов, структуре и функционировании синаптических контактов, работая в противоположном факторам роста направлении. Нестабильное функционирование нейронных сетей является основой многих нейропсихиатрических заболеваний. При повреждениях ЦНС, травмах, нейродегенеративных заболеваниях, старении избыточная экспрессия связанных с миелином ингибиторов регенерации ЦНС тормозит рост аксонов, играет отрицательную роль для реабилитационного потенциала. Изучение аксон-миелиновых отношений, роли окружения аксонов в их дегенерации и регенерации важно для развития подходов к лечению ряда заболеваний и повреждений ЦНС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: elekov2@yandex.ru

Подписаться на рассылку:

Введите Email

Полинейропатия — это патология периферической нервной системы, которая развивается в результате диффузного повреждения периферических нервов и их аксонов. Отсюда и название болезни. В ее основе — генерализованное поражение осевого цилиндра периферических нервов. 

Что такое аксональная полинейропатия

Полиневропатия (второе название — полиневрит) — это клинический синдром, который возникает из-за ряда факторов, влияющих на периферическую нервную систему, и отличается размытыми патогенетическими изменениями. Заболевание занимает одно из лидирующих мест в перечне недугов периферической нервной системы, уступая первенство только вертеброгенной патологии, превосходящей по сложности клинической картины и последствиям, развивающимся из-за нее. 

Аскональная полинейропатия считается междисциплинарной проблемой, с ней часто сталкиваются доктора различных специализаций. В первую очередь с данным заболеванием обращаются к неврологу. Частота возникающего синдрома неизвестна, так как отсутствуют статистические данные. 

На данный момент известны всего три важных патоморфологических механизма, которые лежат в истоках формирования полинейропатии:

• валлеровская дегенерация;
• первичная демиелинизация;
• первичная аксонопатия.

В соответствии с иммунологической теорией полинейропатия является результатом перекрестного образования иммунных глобулинов, уничтожающих собственные клетки, в результате чего возникает некроз тканей и мышечное воспаление.

Исследователи выдвигают ряд гипотез возникновения и проблем течения аксональной полинейропатии:

• Сосудистая. Базируется на вовлечении в процесс сосудов, по которым кислород и питательные вещества поступают в периферические нервы. Изменяются характеристики крови по качественному и количественному составу, что может привести к ишемии нервных окончаний.
• Теория оксидативного стресса. Позиционирует формирование болезни со стороны нарушения обмена оксида азота, вследствие чего изменяются калий-натриевые механизмы, лежащие в основе формирования нервного возбуждения и проведения импульсов по нервам.
• Теория деактивации факторов роста нерва. Говорит о том, что болезнь возникает из-за недостатка аксонального транспорта с последующим развитием аксонопатии.
• Иммунологическая. Объясняет развитие заболевания в результате перекрестного образования антител к структурам периферической нервной системы, которое сопровождается аутоиммунным воспалением, а затем и некрозом нервов.

Даже при использовании ультрасовременных методов диагностики сложно найти достоверную причину патологии, выяснить ее получается только у 50-70% пострадавших.

Факторов возникновения полинейропатии нижних конечностей по аксональному типу очень много. Однако даже инновационные способы исследования не позволяют установить истинную этиологию заболевания.

Мнение эксперта

Автор: Алексей Владимирович Васильев

Руководитель НПЦ болезни двигательного нейрона/БАС, кандидат медицинских наук, врач высшей категории

Аксональная полинейропатия — это одно из самых опасных неврологических заболеваний, сопровождающееся поражением периферической нервной системы. При болезни разрушаются периферические нервные волокна.

Причин возникновение аксональной полинейропатии несколько. Самые распространенные:

1. Сахарный диабет нарушает структуру крови, питающей нервы, в свою очередь происходит сбой в обменных процессах.
2. Длительный дефицит витаминов В. Именно они максимально важны для правильной работы нервной системы, поэтому долгая нехватка способна привести к аксональной полинейропатии.
3. Воздействие токсинов на организм. К ним относят разнообразные отравляющие вещества, например, алкоголь, а также ВИЧ. При отравлении опасными веществами заболевание может развиться уже через несколько дней.
4. Наследственный фактор.
5. Синдром Гийена-Барре.
6. Различные травмы, к которым также относится длительное сдавливание нервов, которое характерно при грыже или остеохондрозе.

Лечение аксональной полинейропатии обязательно должно быть комплексным, иначе нужного эффекта достичь не удастся. Категорически запрещается заниматься самолечением и при возникновении первых же симптомов нужно срочно обратиться к доктору. Врачи Юсуповской больницы подбирают лечение индивидуально для каждого пациента. В зависимости от тяжести патологии и симптоматики назначается комплексное лечение под наблюдением опытных специалистов.

Причины

Самые распространенные причины возникновения аксональной полинейропатии нижних конечностей:

• истощение организма;
• длительный недостаток витаминов группы В;
• недуги, ведущие к дистрофии;
• острые инфекции;
• токсическое поражение ртутью, свинцом, кадмием, угарным газом, спиртными напитками, метиловым спиртом, фосфорорганическими соединениями, медицинскими препаратами, принимаемыми без согласования с врачом;
• болезни сердечно-сосудистой, кроветворной, кровеносной и лимфатической систем;
• эндокринологические патологии, в том числе инсулинозависимость.

Главными факторами, которые провоцируют развитие моторной или сенсомоторной аксональной полинейропатии, являются: 

• эндогенная интоксикация при почечной недостаточности;
• аутоиммунные процессы, протекающие в организме;
• амилоидоз;
• вдыхание токсических веществ или паров.

Также болезнь может быть обусловлена наследственностью. 

Нехватка в организме витаминов группы В, а в особенности пиридоксина и цианокобаламина, крайне негативно воздействует на проводимость нервных и моторных волокон и может вызывать сенсорную аксональную полинейропатию нижних конечностей. Это же происходит при хронической алкогольной интоксикации, глистной инвазии, заболеваниях желудочно-кишечного тракта, которые ухудшают скорость всасывания. 

Токсическое отравление лекарственными препаратами, аминогликозидами, золотыми солями и висмутом занимают большой процент в структуре факторов аксональной невропатии. 

У пациентов с сахарным диабетом нарушена функция периферических нервов из-за нейротоксичности кетоновых тел, то есть метаболитов жирных кислот. Происходит это из-за невозможности организма использовать глюкозу как главный источник энергии. Поэтому вместо нее окисляются жиры.

При аутоиммунных заболеваниях, протекающих в организме, иммунная система человека атакует собственные нервные волокна, воспринимая их как источник опасности. Это происходит из-за провокации иммунитета, возникающей при неосторожном приеме иммуностимулирующих медикаментов и нетрадиционных методик лечения. Поэтому у людей, которые склонны к возникновению аутоиммунных заболеваний, пусковыми факторами аксональной полинейропатии являются:

• иммуностимуляторы;
• вакцины;
• аутогемотерапия.

При амилоидозе в организме накапливается такой белок, как амилоид. Именно он нарушает основные функции нервных волокон.

Первые признаки

Заболевание обычно начинает развиваться с поражения толстых или тонких нервных волокон. Зачастую аксональная полинейропатия имеет дистальное симметричное распределение на кисти или стопы. Нейропатия чаще всего сначала поражает нижние конечности, а затем симметрично распространяется вверх по телу. К самым частым первичным симптомам поражения относят:

• мышечную слабость;
• болевой синдром в конечностях;
• жжение;
• ощущение ползания мурашек;
• онемение кожных покровов.

Симптоматика ярче всего проявляется в вечернее и ночное время суток.

Симптомы

Врачи подразделяют хроническое, острое и подострое течение аксональной полинейропатии. Заболевание подразделяется на два вида: первично-аксональный и демиелинизирующий. В ходе течения болезни к ней присовокупляется демиелинизация, а затем и вторично аксональный компонент. 

К основным проявлениям недуга относятся:

• вялость в мышцах ног или рук;
• спастический паралич конечностей;
• чувство подергивания в мышечных волокнах;
• головокружение при резкой перемене положения тела;
• отек конечностей;
• жжение;
• покалывание;
• ощущение ползания мурашек;
• снижение чувствительности кожных покровов к высокой или низкой температуре, боли и касаниям;
• нарушение ясности речи;
• проблемы с координацией.

Вегетативными признаками сенсомоторной полинейропатии асконального типа считаются следующие симптомы:

• учащенный или, напротив, замедленный сердечный ритм;
• неумеренное потоотделение;
• чрезмерная сухость кожи;
• изменение цвета кожных покровов;
• нарушение эякуляции;
• эректильная дисфункция;
• проблемы с мочеиспусканием;
• сбой двигательных функций желудочно-кишечного тракта;
• повышенное слюнотечение или, наоборот, сухость во рту;

• расстройство аккомодации глаза.

Заболевание проявляется в нарушениях функций поврежденных нервов. Именно периферические нервные волокна отвечают за двигательные функции мышечной ткани, чувствительность, а также оказывают вегетативное воздействие, то есть регулируют сосудистый тонус.

Для нарушения функции проводимости нервов характерны расстройства чувствительности, например:

• чувство ползания мурашек;
• гиперестезия, то есть увеличение чувствительности кожи к внешним раздражителям;
• гипестезия, то есть уменьшение чувствительности;
• отсутствие ощущения собственных конечностей.

Когда поражены вегетативные волокна, то из-под контроля выходит регуляция сосудистого тонуса. При аксонально-демиелинизирующей полинейропатии наступает сдавление капилляров, из-за чего ткани отекают. Нижние, а затем и верхние конечности из-за скапливания в них жидкости существенно увеличиваются в размерах. Так как при полинейропатии нижних конечностей основное количество крови накапливается именно в пораженных областях тела, то у пациента возникает стойкое головокружение при принятии вертикального положения. Из-за того, что пропадает трофическая функция, могут возникнуть эрозивно-язвенные поражения нижних конечностей.

Аксональная моторная полинейропатия проявляется в двигательных нарушениях верхних и нижних конечностей. Когда моторные волокна, отвечающие за движения рук и ног, повреждены, то наступает полный или частичный паралич мышц. Обездвиживание может проявляться совершенно нетипично — может ощущаться как скованность мышечных волокон, так и чрезмерная их расслабленность. При средней степени поражения ослаблен мышечный тонус.

В ходе течения заболевания могут быть усилены или ослаблены сухожильные и надкостничные рефлексы. В редких случаях доктор-невролог их не наблюдает. При болезни часто могут быть поражены черепные нервы, которые проявляются следующими нарушениями:

• глухотой;
• онемением подъязычных мышц и мускулатуры языка;
• невозможностью проглотить еду или жидкость из-за проблем с глотательным рефлексом.

Когда поражен тройничный, лицевой или глазодвигательный нерв, изменяется чувствительность кожных покровов, развиваются параличи, возникает асимметрия лица и подергивание мышц. Иногда при диагностированной аксонально-демиелинизирующей полинейропатии поражения верхних или нижних конечностей могут быть асимметричными. Такое случается при множественной мононейропатии, когда коленные, ахилловы и карпорадиальные рефлексы несимметричны. 

Диагностика

Главной методикой исследования, которая позволяет обнаружить локализацию патологического процесса и степень пораженности нервов, является электронейромиография.

Чтобы определить причину заболевания, врачи назначают следующие анализы:

• определение уровня сахара в плазме крови;
• токсикологические тесты;
• полный анализ мочи и крови;
• выявление уровня холестерина в организме.

Нарушение нервных функций устанавливается при помощи определения температурной, вибрационной и тактильной чувствительности. 

При первичном осмотре применяется зрительная методика исследования. То есть врач, к которому обратился с жалобами пострадавший, осматривает и анализирует такие внешние симптомы, как:

• уровень давления крови в верхних и нижних конечностях;
• чувствительность кожных покровов к прикосновениям и температуре;
• наличие всех необходимых рефлексов;
• диагностика отечности;
• изучение внешнего состояния кожи.

Выявить аксональную полинейропатию можно при помощи следующих инструментальных исследований:

• магнитная резонансная томография;
• биопсия нервных волокон;
• электронейромиография.

Лечение аксональной полинейропатии

Лечение аксональной полинейропатии должно быть комплексным и направленным на причину развития заболевания, его механизмы и симптоматику. Гарантией эффективной терапии является своевременное выявление болезни и лечение, которое сопровождается абсолютным отказом от сигарет, алкоголя и наркотических веществ, ведением здорового образа жизни и соблюдением всех рекомендаций врача. В первую очередь проводятся следующие терапевтические мероприятия:

• избавление от токсического воздействия на организм, если оно присутствует;
• антиоксидантная терапия;
• прием препаратов, которые воздействуют на тонус кровеносных сосудов;
• восполнение дефицита витаминов;
• регулярный контроль концентрации глюкозы в плазме крови.

Отдельное внимание уделяется лечению, направленному на купирование острого болевого синдрома.

Если присутствуют периферические парезы, то есть существенное снижение мышечной силы с многократным уменьшением амплитуды движений, то в обязательном порядке показана лечебная физкультура и специальные физические упражнения, направленные на возвращение тонуса мышечным тканям и предотвращение образования различных контрактур. Особенно важна регулярная психологическая поддержка, которая не дает пациенту впасть в депрессию, сопровождающуюся расстройством сна и чрезмерной нервной возбудимостью.

Лечение аксональной полинейропатии — это продолжительный процесс, так как нервные волокна восстанавливаются долго. Поэтому не стоит ожидать моментального выздоровления и возвращения к привычному образу жизни. Медикаментозная терапия включает такие препараты, как:

• обезболивающее;
• глюкокортикоиды;
• витамины группы В;
• антиоксиданты;
• сосудорасширяющие;
• средства, ускоряющие метаболизм и улучшающие микроциркуляцию крови.

Терапия лекарственными препаратами направлена на восстановление функций нервов, улучшение проводимости нервных волокон и скорости передачи сигналов центральной нервной системе. 

Лечение следует проводить длительными курсами, которые не стоит прерывать, хоть и эффект от них проявляется не сразу. Чтобы устранить болевые ощущения и расстройство сна, назначают следующие медикаменты:

• антидепрессанты;
• противосудорожные;
• препараты, купирующие аритмию;
• обезболивающие.

Для избавления от боли используют нестероидные противовоспалительные препараты. Но стоит помнить, что применять их можно только короткий промежуток времени, так как длительное употребление может привести к повреждению слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

К физиотерапевтическим методам лечения аксональной полинейропатии относятся:

• терапия магнитными волнами;
• грязелечение;
• электростимуляция;
• иглоукалывание;
• лечебный массаж;
• физкультура;
• ультрафонофорез;

• гальванотерапия.

Именно лечебная физкультура позволяет сохранить работоспособность мышечных тканей и поддерживать конечности в нужном положении. Регулярные занятия спортом вернут мышцам тонус, гибкость и увеличат амплитуду движений до нормальной.

Прогноз

Если заболевание обнаружено на ранней стадии и комплексно лечится квалифицированными специалистами, то прогноз для жизни и здоровья пациента более чем благоприятный. Стоит вести правильный образ жизни, рацион должен быть богат витаминами и минералами, необходимыми для правильного функционирования организма.

Если долгое время игнорировать болезнь и не предпринимать никаких действий, результат будет плачевным вплоть до полного паралича. 

Профилактика

Пациент в обязательном порядке должен совершать профилактические мероприятия, которые помогут избежать рецидива или возникновения опасного заболевания. Они включают в себя обогащение рациона витаминами, регулярный контроль уровня сахара в крови, полный отказ от табакокурения, наркотических веществ и алкогольных напитков. 

В целях профилактики болезни рекомендуется:

• носить удобную обувь, которая не пережимает стопу, ухудшая кровоток;
• регулярно осматривать обувь, чтобы избежать образования грибка;
• исключить пешие прогулки на длительные расстояния;
• не стоять долгое время на одном месте;
• мыть ноги прохладной водой или делать контрастные ванночки, что помогает улучшить циркуляцию крови в организме. 

Пострадавшим в стадии ремиссии категорически запрещается принимать лекарственные препараты без согласования с лечащим врачом. Важно своевременно лечить воспалительные заболевания, соблюдать меры предосторожности при работе с токсическими веществами, которые оказывают пагубное воздействие на организм, регулярно выполнять лечебные физические упражнения. 

Дата публикации: 18 декабря, 2021

При большинстве нейродегенеративных заболеваний повреждается не только тело нейронов, но и аксоны, необходимые для передачи нервных импульсов. Механизмы, которые защищают нейроны от разрушения, одновременно ингибируют восстановление аксонов. Это большая проблема в разработке терапии заболеваний, связанных с потерей нейронов — от болезни Альцгеймера до глаукомы. Однако с помощью высокопроизводительного скрининга удалось найти киназы, ингибирование которых приводит и к сохранению нейрона, и к восстановлению аксонов. Хотя механизм этого эффекта до конца не понятен, обнаруженные киназы в будущем могут стать потенциальной мишенью для терапии нейродегенеративных заболеваний.

Развитие нервной системы и ее работа — постоянный баланс между клеточной смертью и выживанием, восстановлением и дегенерацией клеток и связей между ними. Нервная система состоит из множества взаимодействующих между собой нейронов. Соединения между ними, а также взаимодействие нейронов с рецепторами, мышцами и другими тканями и органами устанавливается не только во время эмбрионального развития, но и после рождения. Этот процесс включает в себя возникновение нейронов и их миграцию, появление синапсов, а также и постоянную работу над ошибками. Нейроны, которые неправильно взаимодействуют с соседними клетками или не смогли установить взаимодействие вовсе, и избыточные нейроны, которые были произведены нейрональными клетками-предшественниками «про запас», подлежат уничтожению путем апоптоза. Кроме того, существуют механизмы, которые редактируют только взаимодействие отростков нервных клеток (аксонов и дендритов), и не влияют на жизнеспособность клетки. Нарушение этого процесса может приводить к дефектам развития и нейродегенеративным заболеваниям — болезням Альцгеймера и Паркинсона, а также другим заболеваниям, связанным с потерей нейронов. Развитие и функционирование нервной системы регулируется в организме разными способами, один из которых — сигнальные каскады протеинкиназ.

Протеинкиназы — ферменты, которые присоединяют фосфатную группу к другим белкам (то есть фосфорилируют их). Фосфорилирование влияет на белки, например, активируя их способность к ферментативным реакциям или побуждая формировать белковые комплексы. Протеинкиназы нередко объединены в сигнальные каскады, состоящие из последовательных модулей. На вершине таких каскадов находятся протеинкиназы, реагирующие на внешние сигналы, в роли которых может выступать повреждение клетки, воздействие каких-либо веществ или избыток/недостаток питательных веществ. В ответ на сигнал протеинкиназа фосфорилируется, после чего она сама может фосфорилировать и активировать следующую киназу или киназы в каскаде. Классическим примером таких каскадов являются сигнальные пути митоген-активированных протеинкиназ (MAPK), которые, как правило, состоят из трех модулей (рис. 2).

Киназа киназы MAP-протеинкиназы DLK (Dual leucine zipper kinase — киназа с двойной лейциновой застежкой) — одна из ключевых протеинкиназ в нейронах млекопитающих. Она фосфорилирует протеинкиназы JNK (c-Jun N-terminal kinases), которые в свою очередь фосфорилируют огромное количество белков, связанных с транскрипцией генов, различными сигнальными путями, движением клеток, а также апоптозом. Таким образом, DLK участвует в огромном количестве процессов — порой противоположных друг другу. При развитии нервной системы DLK одновременно контролирует как образование аксонов и миграцию нейронов (за счет фосфорилирования белков, связанных с цитоскелетом), так и апоптоз лишних или нефункциональных нейронов (за счет активации соответствующих белков JNK-киназами). Кроме того, DLK участвует в дегенерации аксонов, но этот процесс не зависит от активности JNK-киназ. Во взрослом организме DLK запускает гибель нейронов в ответ на повреждение при ишемии, травме, отравлении нейротоксинами или нейродегенеративных заболеваниях (K. A. Fernandes et al., 2014. DLK-dependent signaling is important for somal but not axonal degeneration of retinal ganglion cells following axonal injury).

Повреждение аксонов сопутствует большому количеству патологических состояний, а также нормальному старению. Известно, что протеинкиназа DLK участвует в передаче сигнала от поврежденного участка аксона в тело нейрона, приводя к его апоптозу. Такой эффект хорошо изучен на примере ганглионарных клеток сетчатки глаза (см. картинку дня Конусы роста аксонов). Аксоны этих нейронов, объединяясь в зрительный нерв, передают зрительный импульс в мозг. При повреждении зрительного нерва сигнал о повреждении передается в тело нейронов на достаточно большое расстояние (длина зрительного нерва составляет примерно 30 мм).

Одной из стратегий по спасению ганглионарных клеток может быть подавление активности DLK. Действительно, при повреждении зрительного нерва не экспрессирующие DLK ганглионарные клетки выживают гораздо лучше (T. A. Watkins et al., 2013. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury). Но так как DLK также участвует в образовании аксонов, их регенерация невозможна, а восстановление функции нейронов становится все более маловероятным. Поэтому требуется поиск альтернативных методов, которые могли бы одновременно и сохранить поврежденный нейрон и обеспечить регенерацию аксонов.

Исследователи из Калифорнийского университета в Сан-Диего, которые ранее обнаружили роль DLK в регенерации аксонов (T. A. Watkins et al., 2013. DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury), провели поиск новых киназ, которые важны как для сохранения нейрона при повреждении, так и для восстановления аксонов. Для поиска исследователи провели высокопроизводительный скрининг (high-throughput screening) 366 веществ, способных ингибировать 224 известные киназы. Некоторые из этих веществ подавляют активность не одной, а нескольких киназ, поэтому авторы провели скрининг двумя способами. Сначала они искали вещества, которые помогают выживать ганглионарным клеткам после повреждения. Так как каждую клетку нельзя повредить механически, к клеткам добавляли колхицин — вещество, мешающее работе микротрубочек цитоскелета, в том числе в аксонах. Такое химическое повреждение запускает те же механизмы, что и механическое. Во втором скрининге искали вещества, которые увеличивали рост отростков нейронов (аксонов и дендритов). В обоих случаях каждую из 366 молекул добавляли к культурам ганглионарных клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, и наблюдали за исходом с помощью микроскопа.

Альтернативой такому подходу мог бы быть скрининг, в котором последовательно «выключали» гены с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA, small interfering RNA). Но использование молекул решает две задачи. Во-первых, ингибиторы часто влияют на несколько киназ сразу, позволяя очертить круг из нескольких кандидатов, некоторые из которых могут оказаться неизвестными. Во-вторых, если вещество успешно снижает активность киназы, то оно сразу же становится кандидатом в лекарственные препараты или хотя бы в основу для нового лекарственного препарата. А это сохраняет огромное количество времени в последующих исследованиях.

По результатам скрининга вещества разделили на три группы: первая — неактивные вещества, вторая — вещества, увеличивающие выживаемость нейронов и (или) рост отростков нейронов, третья — вещества, уменьшающие эти параметры. При анализе полученных результатов удалось найти уже известные киназы. Ингибирование rho-зависимых киназ (Rho-associated protein kinase) ранее было связано с регенерацией аксонов ганглионарных клеток, а ингибирование циклинзависимых киназ — с их выживаемостью. Среди киназ, которые обеспечивали и то, и другое, выделялись три киназы, которые входят в подсемейство GCK-IV-киназ — MINK1, MAP4K4 и TNIK (рис. 3). Интересно, что эти киназы участвуют в активации DLK в нейронах в ответ на стресс (M. Larhammar et al., 2017. The Ste20 Family Kinases MAP4K4, MINK1, and TNIK Converge to Regulate Stress-Induced JNK Signaling in Neurons).

Роль киназ-кандидатов, безусловно, проверили с помощью альтернативных методов. Снижение их активности ранее известными ингибиторами приводило к увеличению выживаемости ганглионарных клеток и росту аксонов в клеточных культурах. Авторы также смогли изучить последствия того, что будет, если нарушить работу этих киназ в ганглионарных клетках, полученных из сетчатки мышей: снижение активности одновременно трех киназ увеличивало их выживаемость в культуре. Кроме того, нарушение работы киназ защищало нейроны от различных видов повреждений (окислительного стресса, повреждений микротрубочек, повреждения ДНК). После таких результатов настало время исследовать, как протеинкиназы GCK-IV действуют в живом организме.

Исследователям достаточно было изучить, как «выключение» активности киназ влияет на ганглионарные клетки. Поэтому они воспользовались аденоассоциированными вирусами, несущими направляющую РНК (guide RNA) против трех киназ, которые вводили напрямую в глаза трансгенных мышей, экспрессирующих нуклеазу Cas9, или контрольных мышей. Через 14 дней удалось достичь «выключения» целевых генов.

Далее у мышей разрушали зрительный нерв (подробности этой методики описаны в статье Z. Tang et al., 2011. An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival). Эта процедура имитирует то, что происходит в сетчатке пациентов с глаукомой или травмой зрительного нерва: после нарушения целостности аксонов сигнал о повреждении передается в тело ганглионарных клеток, и они отмирают путем апоптоза. Мышам с модифицированными нейронами и контрольным мышам проводили эту процедуру (или имитировали ее), а затем изучали, как выживают ганглионарные клетки. Гипотеза подтвердилась: через две и через десять недель после операции у мышей с нефункциональными протеинкиназами GCK-IV в сетчатке оставалось больше ганглионарных клеток, чем у контрольных животных. Такой же эффект наблюдался при «выключении» уже известной киназы DLK.

А что с аксонами? Авторы повторили описанную выше процедуру, включив в эксперимент вирусы с направляющей РНК против киназы DLK. Через две недели у мышей разрушали зрительный нерв, а через три недели изучали вновь образованные аксоны. У контрольных мышей наблюдали новые, но редкие отростки ганглионарных клеток. У мышей с неактивной киназой DLK, как и предполагалось, аксоны не восстанавливались. В случае неактивных GCK-IV-киназ новые аксоны появлялись, но в недостаточном количестве. Тогда авторы пошли еще на одну уловку — «выключение» гена PTEN. Этот способ помогает восстановить синтез белка в поврежденных нейронах (K. K. Park et al., 2008. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN/mTOR Pathway) — еще одна проблема, которую нужно преодолеть для регенерации аксонов. Снижение уровня PTEN в ганглионарных клетках без DLK не приводит к восстановлению аксонов, зато в клетках, где отсутствовали GCK-IV-киназы, аксоны восстанавливались значительно лучше.

Пока авторы не могут объяснить, за счет чего ингибиторы GCK-IV-киназ одновременно увеличивают выживаемость самих нейронов и их аксонов. Одна из вероятных гипотез состоит в том, что GCK-IV-киназы участвуют в активации DLK. При их «выключении» DLK активируется, но не настолько, чтобы запустить клеточную смерть. В пользу этой гипотезы свидетельствует лишь частичная регенерация аксонов после повреждения зрительного нерва. Вторая гипотеза предполагает, что GCK-IV-киназы участвуют в ответе на повреждение аксонов независимо от DLK. Например, киназа MAP4K4 активируется в ответ на повреждение кардиомиоцитов при окислительном стрессе. «Выключение» этой киназы увеличивает выживаемость и улучшает функцию клеток в этих условиях (L. R. Fiedler et al., 2019. MAP4K4 Inhibition Promotes Survival of Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Reduces Infarct Size In Vivo). При этом в кардиомиоцитах DLK отсутствует.

Тем не менее, наличие еще одной мишени для разработки препаратов, помогающих восстановить утраченные или поврежденные нейроны, не может не радовать. Дальнейшее изучение того, как работают GCK-IV-киназы в нейронах при различных условиях, поможет в этом процессе.

Источник: Amit K. Patel, Risa M. Broyer, Cassidy D. Lee, Tianlun Lu, Mikaela J. Louie, Anna La Torre, Hassan Al-Ali, Mai T. Vu, Katherine L. Mitchell, Karl J. Wahlin, Cynthia A. Berlinicke, Vinod Jaskula-Ranga, Yang Hu, Xin Duan, Santiago Vilar, John L. Bixby, Robert N. Weinreb, Vance P. Lemmon, Donald J. Zack, and Derek S. Welsbie. Inhibition of GCK-IV kinases dissociates cell death and axon regeneration in CNS neurons // PNAS. 2020. DOI: 10.1073/pnas.2004683117.

Екатерина Грачева