Микротрубочки аксонов это

Никита Гудимчук, Павел Захаров, Евгений Ульянов, Фазоил Атауллаханов
«Природа» №10, 2015

Микротрубочки — один из трех основных типов белковых нитей клетки. Вместе с актиновыми и промежуточными филаментами они образуют клеточный каркас — цитоскелет. Благодаря своим уникальным механическим свойствам микротрубочки выполняют целый ряд ключевых функций на всех этапах жизни клетки, в том числе помогают организовать ее содержимое и служат «рельсами» для направленного транспорта внутриклеточных «грузов» — везикул и органелл. Микротрубочки — динамические структуры, они постоянно меняют свою длину за счет роста или укорачивания. Такое поведение, называемое динамической нестабильностью, существенно влияет на различные внутриклеточные процессы. Например, если клетка выпячивает часть цитоплазмы во время амебоидного движения, микротрубочки быстро заполняют новый объем, повышая в нем интенсивность внутриклеточного транспорта. Часть этих филаментов избирательно стабилизируется, тем самым задавая направление, вдоль которого перемещение «грузов» происходит более регулярно. Вдоль выделенной линии активизируются внутриклеточные процессы, а значит, создаются условия для возникновения у клетки полярности. Главенствующую роль динамика микротрубочек играет во время клеточного деления. Их способность менять длину интенсивно исследуется уже более 30 лет, однако механизмы, лежащие в основе этого феномена, все еще плохо изучены.

Строение и свойства микротрубочек

Микротрубочки — это линейные полимеры. Они построены из димеров белка тубулина, которые образуют 13 цепей — протофиламентов (рис. 1). Каждый из них по бокам связан с двумя другими, и вся конструкция замкнута в цилиндр диаметром 25 нм. Такое строение обеспечивает микротрубочке прочность и большую изгибную жесткость: она может оставаться почти абсолютно прямой в масштабе клетки. Чтобы представить, насколько микротрубочка сложно сгибаема, мысленно увеличим ее до размеров стержня диаметром спагетти (около 2 мм). Такая «спица» не прогибалась бы, будь она длиной даже в сотни метров (высота современных небоскребов)! Жесткость позволяет микротрубочкам выполнять роль длинных прямых направляющих, которые организуют движение органелл внутри клетки. Остальные элементы цитоскелета (актиновые и промежуточные филаменты) существенно более гибкие, поэтому, как правило, используются клеткой в других целях.

Димер тубулина, из которого строится микротрубочка, состоит из мономеров двух типов. Внутри каждого протофиламента α-мономеры одного димера соединяются с β-мономерами соседнего. Поэтому по всей длине микротрубочки, содержащей десятки и сотни тысяч димеров тубулина, все они ориентированы одинаково. Тот конец микротрубочки, к которому обращены α-тубулины, называется минус-концом, а противоположный — плюс-концом. Благодаря такому упорядоченному расположению димеров микротрубочка имеет полярность, что обеспечивает направленность транспорта. Моторные белки, которые участвуют в перемещении «грузов» из одной части клетки в другую, «шагают» по микротрубочке, перетаскивая свою «ношу» за собой, как правило, только в одном направлении. Например, белок динеин двигает органеллы к минус-концу микротрубочки, а кинезин — к плюс-концу. Часто микротрубочки расположены в клетке радиально, а их плюс-концы направлены к ее периферии. Таким образом, кинезины осуществляют транспортировку из центра к внешней мембране, а динеины — от нее внутрь клетки. Поразительно, но в отростках аксонов везикулы и органеллы могут направленно передвигаться по микротрубочкам на расстояния в сотни микрометров и больше.

Динамическая нестабильность: в клетках и в пробирке

От обычных биополимеров микротрубочки отличаются не только механическими свойствами, но и уникальным динамическим поведением (рис. 2). Обычный полимер растет монотонно до тех пор, пока скорость присоединения новых субъединиц из раствора не сравняется со скоростью отделения уже прикрепленных. Полимеризация же микротрубочки носит колебательный характер. Ее длина попеременно то увеличивается, то уменьшается при фиксированной концентрации димеров тубулина в растворе. В одних и тех же условиях сосуществуют растущие и укорачивающиеся микротрубочки. Переходы от стадии роста к укорочению называют катастрофами, а обратные — спасениями. Впервые такое поведение — динамическую нестабильность — обнаружили Т. Митчисон (T. Mitchison) и М. Киршнер (M. Kirschner) около 30 лет назад [1].

Динамическая нестабильность микротрубочек особенно важна во время митоза. Из них строится специальный аппарат для разделения клетки — веретено деления. Оно центрируется благодаря микротрубочкам, которые отталкиваются от клеточной мембраны. Далее, удлиняясь и укорачиваясь, они «обыскивают» пространство клетки в поисках хромосом. Отыскав их и закрепившись за них своими концами, микротрубочки развивают тянущие и толкающие силы, перемещая хромосомы к экватору клетки. Четко выстроив на нем генетический материал и тем самым обеспечив готовность клетки к разделению, микротрубочки растаскивают хромосомы к клеточным полюсам. Все это происходит благодаря динамической нестабильности микротрубочек. Незаменимая роль динамики микротрубочек в митозе привела к разработке лекарств от онкологических заболеваний. Так, например, низкомолекулярное вещество таксол — известный противоопухолевый препарат, стабилизирующий микротрубочки, а значит, останавливающий деление раковых клеток.

Нестабильность микротрубочек проявляется не только в клетках, но и в пробирке — в растворе образующего их белка. Следовательно, для проявления ими этого свойства не требуется ничего, кроме тубулина. Он присоединяется из раствора к концу микротрубочки во время фазы ее роста или, наоборот, отделяется и уходит обратно в раствор во время стадии укорачивания. Тем не менее, другие клеточные белки могут влиять на параметры динамической нестабильности, например, ускорять рост микротрубочек в клетках, менять (увеличивать или уменьшать) частоты катастроф и спасений. Известно, что в пробирке скорость роста микротрубочек и эти частоты многократно ниже, чем в клетках при той же концентрации тубулина.

Модель ГТФ-«шапочки»

Почему микротрубочки, в отличие от других биополимеров, динамически нестабильны? Рост микротрубочки, как сказано, происходит благодаря присоединению к ее концу димеров тубулина. Каждый мономер этого белка связан с молекулой гуанозинтрифосфата (ГТФ). Однако вскоре после присоединения тубулина к микротрубочке молекула ГТФ, связанная с β-субъединицей, гидролизуется до гуанозиндифосфата (ГДФ). ГТФ-димеры тубулина в составе протофиламента стремятся вытянуться, образовать линейную структуру, а ГДФ-димеры — изогнуться в рожок с радиусом кривизны около 20 нм. За счет постоянного присоединения ГТФ-димеров микротрубочка удлиняется, а на ее конце формируется «пояс» из молекул, еще не успевших гидролизовать ГТФ. Пытаясь выпрямиться, этот слой — ГТФ-«колпачок» (или «шапочка») — не дает выгнуться наружу нижележащим ГДФ-димерам и таким образом предохраняет растущий конец микротрубочки от разборки. Считается, что микротрубочка устойчиво растет и защищена от катастрофы, пока на ее конце есть ГТФ-«шапочка». Исчезновение последней в результате гидролиза или случайного отделения ГТФ-димеров тубулина переводит микротрубочку в фазу укорочения.

Модель ГТФ-«шапочки» появилась практически сразу после открытия динамической нестабильности и покорила исследователей своей простотой и элегантностью. Получено уже довольно много экспериментальных фактов, подтверждающих эту модель. Один из классических опытов, показывающих, что на конце микротрубочки есть некая стабилизирующая структура, заключается в следующем. Растущую микротрубочку перерезают микроиглой или сфокусированным пучком ультрафиолетового света [2, 3]. Плюс-конец с отрезанной стороны немедленно начинает разбираться. Интересно, что минус-конец со стороны разреза обычно не разбирается, а продолжает расти. Р. Никлас (R. Nicklas) делал похожий опыт, но разрезал с помощью микроиглы микротрубочку в митотическом веретене внутри клетки [4]. Как и в предыдущем случае, микротрубочка тут же разбиралась со стороны разреза на плюс-конце и оставалась стабильной на минус-конце. Поведение последнего до сих пор остается загадкой, но результаты этих экспериментов сочли сильным доводом, подтверждающим наличие на растущем плюс-конце микротрубочки стабилизирующей ГТФ-«шапочки».

Другой важный аргумент в пользу этой модели появился, когда создали химически модифицированный ГТФ — очень похожий на свой прообраз, но практически неспособный к гидролизу. Когда в растворе плавают только такие молекулы, микротрубочки хорошо растут, но никогда не испытывают катастрофы [5]. Такое поведение подтверждает гипотезу о ГТФ-«шапочке»: ее слабогидролизуемый аналог никак не меняется со временем, а значит, не позволяет микротрубочке разбираться.

Косвенных доказательств существования ГТФ-«шапочки» много, однако ее до сих пор не удалось напрямую увидеть (хотя такие попытки предпринимались). По крайней мере, оценили размер минимальной структуры из слабогидролизуемого аналога ГТФ, которой достаточно, чтобы стабилизировать рост микротрубочки. Защитить ее от разборки, как оказалось, может «шапочка» всего в один слой димеров (при этом реально она может быть и толще). Наглядный способ оценить количество ГТФ-димеров на конце растущей микротрубочки — добавить белок с флуоресцентной меткой, который их распознает. Так называемый плюс-концевой белок EB1 in vitro светится на расстоянии порядка сотни слоев тубулина, причем интенсивность флуоресценции падает от конца к телу микротрубочки. Если этот белок действительно предпочитает связываться именно с ГТФ-димерами, то подобное распределение свечения указывает на то, что ГТФ-«шапочка» может быть значительно больше одного слоя. Примечательно, что белок ЕВ1 ярко окрашивает концы растущих микротрубочек, но начинает гаснуть за несколько секунд перед переходом филамента к катастрофе, как будто отражая постепенное исчезновение стабилизирующей ГТФ-«шапочки» [6]. Измеренная интенсивность флуоресценции белка EB1 на концах микротрубочек в живых клетках также свидетельствует в пользу большой (существенно толще одного слоя тубулинов) ГТФ-«шапочки» [7]. Кроме мечения микротрубочек белком EB1, «шапочку» также визуализировали в клетках с помощью специальных антител, узнающих ГТФ-тубулин [8]. Интересно, что они связывались не только с концами микротрубочек, но и образовывали «островки» на остальной поверхности.

Микротрубочки стареют?

Модель ГТФ-«шапочки» привлекла внимание исследователей прежде всего потому, что позволила объяснить, почему микротрубочка может устойчиво расти и укорачиваться и почему между этими фазами возможны переходы — катастрофы и спасения.

В 1995 г. Д. Одде (D. Odde) с соавторами провел простой, но важный эксперимент [9]. Они наблюдали за ростом микротрубочек в пробирке и решили построить распределение их длин. Оно предполагалось экспоненциальным, но оказалось, что у него есть пик (рис. 3). Значит, в начале роста микротрубочки имеют очень маленькую вероятность испытать катастрофу, а дальше, по мере их роста, эта вероятность повышается. Если пересчитать распределение длин микротрубочек в частоты катастроф, то получится возрастающая зависимость частоты катастроф от времени. Этот эффект назвали «старением» микротрубочек — они как будто «портятся» со временем. Иначе говоря, «молодые» микротрубочки могут расти стабильно, а «старые» уже более склонны к разборке. Необычное распределение времен жизни микротрубочек хорошо аппроксимируется гамма-распределением, которое характеризует процессы с фиксированным количеством последовательных шагов. Поэтому возникла идея, что лучше всего результаты проведенного эксперимента описывает теория, согласно которой катастрофа микротрубочки происходит за три последовательных стадии, когда в ней накопились определенные дефекты неизвестной природы [10]. Эта гипотеза, исходно достаточно сомнительная, тем не менее существенно подогрела интерес к исследованию динамики микротрубочек на уровне отдельных димеров тубулина.

Чего пока не может эксперимент и как помогает теория?

Обнаруженный феномен «старения» микротрубочек показал, что общепринятая, ставшая классической, модель ГТФ-«шапочки» — некоторое упрощение. Действительно, она только постулирует, что микротрубочка испытывает катастрофу, когда теряет свой стабилизирующий «колпачок», но не объясняет, как и почему это происходит, а также из-за чего же вообще микротрубочка может «стареть». Что за таинственные дефекты накапливаются внутри «стареющей» микротрубочки, приводя ее к катастрофе? Сколько их и в какой последовательности они должны проявляться? Может быть, речь идет о гидролизе отдельных молекул ГТФ внутри «шапочки» или о каком-то другом процессе, зависящем от не установленных пока событий совсем иной природы?

Естественно, исследователи хотели бы как можно тщательнее разглядеть «живые» микротрубочки, чтобы ответить на эти вопросы. Однако современный экспериментальный арсенал не позволяет это сделать. Мы можем или увидеть замороженную (обездвиженную) микротрубочку с нанометровым разрешением, например, с помощью электронного микроскопа, или проследить динамику микротрубочки со скоростью сотни кадров в секунду под оптическим микроскопом. К сожалению, невозможно получить соответствующие данные одновременно, чтобы четко их соотнести. Во многом по вине таких ограничений современной науке неизвестно, каков точный размер ГТФ-«шапочки» и как он меняется со временем, а также какую форму имеют концы микротрубочек и как она определяет их динамику.

На помощь экспериментам приходят теоретические методы исследования, в частности компьютерное моделирование. Оно может воссоздать микротрубочку с очень высоким пространственно-временным разрешением, правда, ценой неизбежных идеализаций и упрощений, адекватность которых нужно тщательно проверять (сравнивая результаты модельного и настоящего экспериментов). Идеальная компьютерная модель должна описывать все имеющиеся экспериментальные данные. Тогда на ее основе можно будет изучить механизмы наблюдаемого поведения микротрубочек и предсказать принцип действия белков, влияющих на динамику этих филаментов в клетках. Также станет возможным подбор химических соединений для управления поведением микротрубочек в медицинских целях.

На сегодняшний день создано множество моделей микротрубочек — от очень простых до весьма сложных. Самыми лучшими оказались наиболее детальные модели — молекулярные, которые учитывают, что микротрубочка состоит из многих протофиламентов и что ее структура дискретна (совокупность отдельных субъединиц — тубулинов). Первые такие модели стали появляться почти сразу после обнаружения динамической нестабильности в 1984 г. Работая с ансамблем взаимодействующих тубулинов, они воссоздают поведение микротрубочки как целого. Со времен первых молекулярных моделей накопилось много новых экспериментальных данных о микротрубочках. С тех пор уточнили их строение, измерили новые зависимости характеристик роста и укорочения от различных параметров, изучили поведение этих филаментов после разбавления тубулина, оценили размер ГТФ-«шапочки», открыли способность концов микротрубочек развивать тянущие и толкающие силы [11–19]. Это позволяло корректировать расчеты и все точнее задавать параметры взаимодействия тубулинов. Однако росли и требования к моделям, поскольку они должны непротиворечиво описывать весь набор имеющихся экспериментальных результатов. Таким образом, способы описания взаимодействия тубулинов совершенствовались и усложнялись. От простых моделей, где субъединицы либо взаимодействуют друг с другом, либо нет, перешли к так называемым молекулярно-механическим (самым современным и наиболее реалистичным). Они рассматривают молекулы тубулина как физические объекты, подчиняющиеся законам механики и движущиеся в поле тепловых соударений и потенциалов притяжения друг к другу [20–22]. В ранних молекулярно-механических расчетах динамики микротрубочек из-за ограниченной производительности компьютеров нельзя было подробно описать взаимодействие тубулинов на основе уравнений движения и с учетом тепловых колебаний. Однако эта цель оставалась очень притягательной для нашей команды, поскольку мы предполагали, что тепловые флуктуации играют существенную роль в динамике микротрубочек.

Новая молекулярно-механическая модель

Ускорения расчетов нам удалось достичь главным образом за счет технологии параллельных вычислений на крупнейшем суперкомпьютере «Ломоносов» (в вычислительном центре МГУ) [23]. Он способен производить 1,7·10¹⁵ операций в секунду, что выводит его на первое место в Восточной Европе по производительности.

В рамках нашей новой модели субъединицы тубулина — это шарики, на поверхности которых размещены центры взаимодействий с «соседями» (рис. 4). Рассматриваются два типа взаимодействий — продольные и боковые. Сами шарики могут существовать в двух состояниях, соответствующих ГТФ- и ГДФ-формам. В первом случае центры шариков стремятся выстроиться вдоль прямой, а во втором — вдоль дуги, соответствующей углу 22° (для каждой пары субъединиц). Центры взаимодействия притягиваются на близких расстояниях и перестают «чувствовать» друг друга на больших. Движения шариков описываются уравнениями Ланжевена (следствиями второго закона Ньютона), в которых мы пренебрегаем членами, содержащими ускорения частиц (так как эти слагаемые малы по сравнению с остальными). Субъединицы тубулина, удалившиеся от микротрубочки на расстояние, где они перестают с ней взаимодействовать, исключаются из рассмотрения. Также в систему периодически с некоторой вероятностью вводятся новые ГТФ-тубулины, которые появляются в случайной позиции на конце микротрубочки. Внутри нее они могут с определенной вероятностью подвергаться гидролизу — превращаться в ГДФ-субъединицы, которые тут же хотят расположиться по дуге, т. е. сформировать изогнутый протофиламент. Но последний необязательно сразу изгибается, так как от этого его могут удерживать боковые связи. Полученная таким образом система взаимодействующих тубулинов эволюционирует во времени: микротрубочка растет, испытывает катастрофу, укорачивается, спасается и вновь удлиняется. При этом наша модель хорошо описывает характерные формы концов растущей и укорачивающейся микротрубочек, воспроизводит наблюдаемые в экспериментах зависимости динамических характеристик от концентрации тубулина в растворе, а также феномен «старения» микротрубочек. Итак, с помощью моделирования, исходя из простых и понятных принципов и без каких-либо экзотических допущений, мы получили на экране компьютера виртуальную микротрубочку — объект, обладающий всеми основными свойствами своего реального прототипа. Рассчитав координаты всех субъединиц микротрубочки, мы можем с беспрецедентными разрешением и достоверностью узнать все о каждом элементе модельной микротрубочки в любой момент времени. Остается только проанализировать сложную последовательность событий в жизни микротрубочки и понять, какие из них и как приводят ее к переключению от роста к укорачиванию.

Что же происходит с микротрубочкой перед катастрофой? Сначала мы выяснили, выполняется ли в нашей модели какой-либо из двух ранее предложенных гипотетических сценариев этого события. Согласно одному из них, в структуре микротрубочки по мере ее роста могут возникать и сохраняться дефекты, например «дырки» в стенке, возникающие из-за того, что один из протофиламентов замедляет или прекращает свой рост (рис. 5, а) [10]. В нашей модели нет никаких искусственно вложенных оснований для приостановки роста отдельных протофиламентов. Поэтому такая ситуация практически никогда не реализуется, а следовательно, не может быть объяснением механизма «старения» микротрубочек и возникновения катастроф. Вторая гипотеза гласит, что увеличение склонности микротрубочки испытывать катастрофы («старение») происходит по мере постепенного заострения ее конца (рис. 5, б) [24]. Мы тщательно изучили разброс длин у протофиламентов микротрубочки в нашей модели и выяснили, что он быстро достигает некоей устойчивой формы, после чего микротрубочка остается с этим уровнем заостренности. Даже если искусственно создать конфигурацию микротрубочки с концом, в котором длины отдельных протофиламентов будут сильно различаться, то довольно скоро растущая белковая нить, предоставленная сама себе, достигнет все того же устойчивого уровня заостренности, к которому она обычно стремится. Таким образом, медленное заострение конца растущей микротрубочки тоже не может объяснить феномен ее «старения» в нашей модели. Мы также обратили внимание, что и размер ГТФ-«шапочки» не имеет тенденции постепенно уменьшаться (хотя существенно колеблется во время роста микротрубочки), а значит, он не может быть причиной катастрофы.

Отсутствие явного кандидата на медленный необратимый дестабилизирующий процесс привело нас к мысли, что, возможно, его и вовсе нет. А катастрофа происходит не в результате медленного накопления каких-либо дефектов, а из-за возникновения множества короткоживущих обратимых событий. Они время от времени накапливаются на конце микротрубочки и тогда приводят ее к катастрофе (рис. 5, в). Наиболее вероятное событие, приводящее к дестабилизации микротрубочки, — возникновение изогнутого «рожка» на ее конце. Действительно, если протофиламент отогнулся, то даже в случае присоединения к его концу новых субъединиц тубулина из раствора микротрубочка не становится более стабильной и продолжает укорачиваться. Однако один изогнутый протофиламент может легко обломиться и отделиться от микротрубочки. Поэтому по-настоящему дестабилизирующий эффект будут оказывать только несколько изогнутых протофиламентов, образовавшихся на конце микротрубочки одновременно. Количество непрямых протофиламентов, возникающих незадолго до катастрофы в наших расчетах, подтверждает этот вывод.

Таким образом, компьютерное моделирование позволило пролить свет на механизм возникновения катастроф. Оказалось, что в этом процессе важную роль играет не только число ГТФ-димеров, но и механические конфигурации протофиламентов. Катастрофа — результат единовременного образования множества обратимых короткоживущих событий (изогнутых протофиламентов) на конце микротрубочки. Это дополняет классическую модель ГТФ-«шапочки» недостающими деталями, объясняя, как и почему может происходить катастрофа микротрубочки. Мы надеемся, что компьютерное моделирование со временем позволит ответить и на другие вопросы о динамике этих филаментов. Каков механизм спасения микротрубочек? Почему их плюс- и минус-концы в экспериментах по перерезанию пучком ультрафиолетового света или микроиглой ведут себя по-разному? Как белки-модуляторы и потенциальные лекарства воздействуют на динамику микротрубочек?

Работа выполнена при финансовой поддержке фонда «Династия» (грант для молодых биологов) и гранта Президента РФ для молодых кандидатов наук.

Литература
1. Mitchison T., Kirschner M. Dynamic instability of microtubule growth // Nature. 1984. V. 312. P. 237–242.
2. Walker R. A., Inoué S., Salmon E. D. Asymmetric behavior of severed microtubule ends after ultraviolet-microbeam irradiation of individual microtubules in vitro // J. Cell Biol. 1989. V. 108. P. 931–937.
3. Tran P. T., Walker R. A., Salmon E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends // J. Cell Biol. 1997. V. 138. P. 105–117. doi: 10.1083/jcb.138.1.105.
4. Nicklas R. B., Lee G. M., Rieder C. L. et al. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules // J. Cell Sci. 1989. V. 94. P. 415–423.
5. Hyman A. A., Salser S., Drechsel D. N. et al. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP // Mol. Biol. Cell. 1992. V. 3. P. 1155–1167. doi: 10.1091/mbc.3.10.1155.
6. Maurer S. P., Fourniol F. J., Bohner G. et al. EBs recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends // Cell. 2012. V. 149. P. 371–382. doi: 10.1016/j.cell.2012.02.049.
7. Seetapun D., Castle B. T., McIntyre A. J. et al. Estimating the microtubule GTP cap size in vivo // Curr. Biol. 2012. V. 22. P. 1681–1687. doi: 10.1016/j.cub.2012.06.068.
8. Dimitrov A., Quesnoit M., Moutel S. et al. Detection of GTP-tubulin conformation in vivo reveals a role for GTP remnants in microtubule rescues // Science. 2008. V. 322. P. 1353–1356. doi: 10.1126/science.1165401.
9. Odde D. J., Cassimeris L., Buettner H. M. Kinetics of microtubule catastrophe assessed by probabilistic analysis // Biophys. J. 1995. V. 69. P. 796–802. doi: 10.1016/S0006-3495(95)79953-2.
10. Gardner M. K., Zanic M., Gell C. et al. Depolymerizing kinesins Kip3 and MCAK shape cellular microtubule architecture by differential control of catastrophe // Cell. 2011. V. 147. P. 1092–1103. doi: 10.1016/j.cell.2011.10.037.
11. Mandelkow E. M., Mandelkow E., Milligan R. A. Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo-electron microscopy study // J. Cell Biol. 1991. V. 114. P. 977–991.
12. Walker R. A., O’Brien E. T., Pryer N. K. et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies // J. Cell Biol. 1988. V. 107. P. 1437–1448.
13. Walker R. A., Pryer N. K., Salmon E. D. Dilution of individual microtubules observed in real time in vitro: evidence that cap size is small and independent of elongation rate // J. Cell Biol. 1991. V. 114. P. 73–81.
14. Voter W. A., O’Brien E. T., Erickson H. P. Dilution-induced disassembly of microtubules: relation to dynamic instability and the GTP cap // Cell Motil. Cytoskeleton. 1991. V. 18. P. 55–62.
15. O’Brien E. T., Voter W. A., Erickson H. P. GTP hydrolysis during microtubule assembly // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 4148–4156.
16. Drechsel D. N., Kirschner M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules // Curr. Biol. 1994. V. 4. P. 1053–1061. doi: 10.1016/S0960-9822(00)00243-8.
17. Caplow M., Shanks J. Evidence that a single monolayer tubulin-GTP cap is both necessary and sufficient to stabilize microtubules // Mol. Biol. Cell. 1996. V. 7. P. 663–675. doi: 10.1091/mbc.7.4.663.
18. Grishchuk E. L., Molodtsov M. I., Ataullakhanov F. I. et al. Force production by disassembling microtubules // Nature. 2005. V. 438. P. 384–388. doi: 10.1038/nature04132.
19. Dogterom M., Yurke B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules // Science. 1997. V. 278. P. 856–860. doi: 10.1126/science.278.5339.856.
20. Molodtsov M. I., Ermakova E. A., Shnol E. E. et al. A molecular-mechanical model of the microtubule // Biophys. J. 2005. V. 88. P. 3167–3179. doi: 10.1529/biophysj.104.051789.
21. VanBuren V., Cassimeris L., Odde D. J. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics // Biophys. J. 2005. V. 89. P. 2911–2926. doi: 10.1529/biophysj.105.060913.
22. Efremov A., Grishchuk E. L., McIntosh J. R. et al. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 19017–19022. doi: 10.1073/pnas.0709524104.
23. Воеводин В. В., Жуматий С. А., Соболев С. И. и др. Практика суперкомпьютера «Ломоносов» // Открытые системы. 2012. Т. 7. С. 36–39.
24. Coombes C. E., Yamamoto A., Kenzie M. R. et al. Evolving tip structures can explain age-dependent microtubule catastrophe // Curr. Biol. 2013. V. 23. P. 1342–1348. doi: 10.1016/j.cub.2013.05.059.

Microtubules are polymers of tubulin that form part of the cytoskeleton and provide structure and shape to eukaryotic cells. Microtubules can be as long as 50 micrometres, as wide as 23 to 27 nm^[2] and have an inner diameter between 11 and 15 nm.^[3] They are formed by the polymerization of a dimer of two globular proteins, alpha and beta tubulin into protofilaments that can then associate laterally to form a hollow tube, the microtubule.^[4] The most common form of a microtubule consists of 13 protofilaments in the tubular arrangement.

Microtubules play an important role in a number of cellular processes. They are involved in maintaining the structure of the cell and, together with microfilaments and intermediate filaments, they form the cytoskeleton. They also make up the internal structure of cilia and flagella. They provide platforms for intracellular transport and are involved in a variety of cellular processes, including the movement of secretory vesicles, organelles, and intracellular macromolecular assemblies.^[5] They are also involved in cell division (by mitosis and meiosis) and are the main constituents of mitotic spindles, which are used to pull eukaryotic chromosomes apart.

Microtubules are nucleated and organized by microtubule-organizing centres, such as the centrosome found in the center of many animal cells or the basal bodies of cilia and flagella, or the spindle pole bodies found in most fungi.

There are many proteins that bind to microtubules, including the motor proteins dynein and kinesin, microtubule-severing proteins like katanin, and other proteins important for regulating microtubule dynamics.^[6] Recently an actin-like protein has been found in the gram-positive bacterium Bacillus thuringiensis, which forms a microtubule-like structure called a nanotubule, involved in plasmid segregation.^[7] Other bacterial microtubules have a ring of five protofilaments.

History[edit]

Tubulin and microtubule-mediated processes, like cell locomotion, were seen by early microscopists, like Leeuwenhoek (1677). However, the fibrous nature of flagella and other structures were discovered two centuries later, with improved light microscopes, and confirmed in the 20th century with the electron microscope and biochemical studies.^[8]

In vitro assays for microtubule motor proteins such as dynein and kinesin are researched by fluorescently tagging a microtubule and fixing either the microtubule or motor proteins to a microscope slide, then visualizing the slide with video-enhanced microscopy to record the travel of the motor proteins. This allows the movement of the motor proteins along the microtubule or the microtubule moving across the motor proteins.^[9] Consequently, some microtubule processes can be determined by kymograph.^[10]

Structure[edit]

In eukaryotes, microtubules are long, hollow cylinders made up of polymerised α- and β-tubulin dimers.^[12] The inner space of the hollow microtubule cylinders is referred to as the lumen. The α and β-tubulin subunits are ~50% identical at the amino acid level, and both have a molecular weight of approximately 50 kDa.^[13][14]

These α/β-tubulin dimers polymerize end-to-end into linear protofilaments that associate laterally to form a single microtubule, which can then be extended by the addition of more α/β-tubulin dimers. Typically, microtubules are formed by the parallel association of thirteen protofilaments, although microtubules composed of fewer or more protofilaments have been observed in various species ^[15] as well as in vitro.^[16]

Microtubules have a distinct polarity that is critical for their biological function. Tubulin polymerizes end to end, with the β-subunits of one tubulin dimer contacting the α-subunits of the next dimer. Therefore, in a protofilament, one end will have the α-subunits exposed while the other end will have the β-subunits exposed. These ends are designated the (−) and (+) ends, respectively. The protofilaments bundle parallel to one another with the same polarity, so, in a microtubule, there is one end, the (+) end, with only β-subunits exposed, while the other end, the (−) end, has only α-subunits exposed. While microtubule elongation can occur at both the (+) and (−) ends, it is significantly more rapid at the (+) end.^[17]

The lateral association of the protofilaments generates a pseudo-helical structure, with one turn of the helix containing 13 tubulin dimers, each from a different protofilament. In the most common «13-3» architecture, the 13th tubulin dimer interacts with the next tubulin dimer with a vertical offset of 3 tubulin monomers due to the helicity of the turn. There are other alternative architectures, such as 11-3, 12-3, 14-3, 15-4, or 16-4, that have been detected at a much lower occurrence.^[18] Microtubules can also morph into other forms such as helical filaments, which are observed in protist organisms like foraminifera.^[19] There are two distinct types of interactions that can occur between the subunits of lateral protofilaments within the microtubule called the A-type and B-type lattices. In the A-type lattice, the lateral associations of protofilaments occur between adjacent α and β-tubulin subunits (i.e. an α-tubulin subunit from one protofilament interacts with a β-tubulin subunit from an adjacent protofilament). In the B-type lattice, the α and β-tubulin subunits from one protofilament interact with the α and β-tubulin subunits from an adjacent protofilament, respectively. Experimental studies have shown that the B-type lattice is the primary arrangement within microtubules. However, in most microtubules there is a seam in which tubulin subunits interact α-β.^[20]

The sequence and exact composition of molecules during microtubule formation can thus be summarised as follows: A β-tubulin connects in the context of a non-existent covalent bond with an α-tubulin, which in connected form are a heterodimer, since they consist of two different polypeptides (β-tubulin and α-tubulin). So after the heterodimers are formed, they join together to form long chains that rise figuratively in one direction (e.g. upwards). These heterodimers, which are connected in a certain direction, form protofilaments. These long chains (protofilaments) now gradually accumulate next to each other so that a tube-like structure is formed, which has a lumen typical of a tube. Accordingly, mostly 13 protofilaments form the outer wall of the microtubules. The heterodimers consist of a positive and negative end, with alpha-tubulin forming the negative end and beta-tubulin the positive end. Due to the fact that the heterodimers are stacked on top of each other, there is always a negative and positive end. Microtubules grow by an addition of heterodimers at the plus end.

Some species of Prosthecobacter also contain microtubules. The structure of these bacterial microtubules is similar to that of eukaryotic microtubules, consisting of a hollow tube of protofilaments assembled from heterodimers of bacterial tubulin A (BtubA) and bacterial tubulin B (BtubB). Both BtubA and BtubB share features of both α- and β-tubulin. Unlike eukaryotic microtubules, bacterial microtubules do not require chaperones to fold.^[21] In contrast to the 13 protofilaments of eukaryotic microtubules, bacterial microtubules comprise only five.^[22]

Intracellular organization[edit]

Microtubules are part of the cytoskeleton, a structural network within the cell’s cytoplasm. The roles of the microtubule cytoskeleton include mechanical support, organization of the cytoplasm, transport, motility and chromosome segregation. In developing neurons microtubules are known as neurotubules,^[23] and they can modulate the dynamics of actin, another component of the cytoskeleton.^[24] A microtubule is capable of growing and shrinking in order to generate force, and there are motor proteins that allow organelles and other cellular components to be carried along a microtubule. This combination of roles makes microtubules important for organizing and moving intracellular constituents.

The organization of microtubules in the cell is cell-type specific. In epithelia, the minus-ends of the microtubule polymer are anchored near the site of cell-cell contact and organized along the apical-basal axis. After nucleation, the minus-ends are released and then re-anchored in the periphery by factors such as ninein and PLEKHA7.^[25] In this manner, they can facilitate the transport of proteins, vesicles and organelles along the apical-basal axis of the cell. In fibroblasts and other mesenchymal cell-types, microtubules are anchored at the centrosome and radiate with their plus-ends outwards towards the cell periphery (as shown in the first figure). In these cells, the microtubules play important roles in cell migration. Moreover, the polarity of microtubules is acted upon by motor proteins, which organize many components of the cell, including the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus.

Microtubule polymerization[edit]

Nucleation[edit]

Nucleation is the event that initiates the formation of microtubules from the tubulin dimer. Microtubules are typically nucleated and organized by organelles called microtubule-organizing centres (MTOCs). Contained within the MTOC is another type of tubulin, γ-tubulin, which is distinct from the α- and β-subunits of the microtubules themselves. The γ-tubulin combines with several other associated proteins to form a lock washer-like structure known as the «γ-tubulin ring complex» (γ-TuRC). This complex acts as a template for α/β-tubulin dimers to begin polymerization; it acts as a cap of the (−) end while microtubule growth continues away from the MTOC in the (+) direction.^[26]

The centrosome is the primary MTOC of most cell types. However, microtubules can be nucleated from other sites as well. For example, cilia and flagella have MTOCs at their base termed basal bodies. In addition, work from the Kaverina group at Vanderbilt, as well as others, suggests that the Golgi apparatus can serve as an important platform for the nucleation of microtubules.^[27] Because nucleation from the centrosome is inherently symmetrical, Golgi-associated microtubule nucleation may allow the cell to establish asymmetry in the microtubule network. In recent studies, the Vale group at UCSF identified the protein complex augmin as a critical factor for centrosome-dependent, spindle-based microtubule generation. It that has been shown to interact with γ-TuRC and increase microtubule density around the mitotic spindle origin.^[28]

Some cell types, such as plant cells, do not contain well defined MTOCs. In these cells, microtubules are nucleated from discrete sites in the cytoplasm. Other cell types, such as trypanosomatid parasites, have a MTOC but it is permanently found at the base of a flagellum. Here, nucleation of microtubules for structural roles and for generation of the mitotic spindle is not from a canonical centriole-like MTOC.

Polymerization[edit]

Following the initial nucleation event, tubulin monomers must be added to the growing polymer. The process of adding or removing monomers depends on the concentration of αβ-tubulin dimers in solution in relation to the critical concentration, which is the steady state concentration of dimers at which there is no longer any net assembly or disassembly at the end of the microtubule. If the dimer concentration is greater than the critical concentration, the microtubule will polymerize and grow. If the concentration is less than the critical concentration, the length of the microtubule will decrease.^[29]

Microtubule dynamics[edit]

Dynamic instability[edit]

Dynamic instability refers to the coexistence of assembly and disassembly at the ends of a microtubule. The microtubule can dynamically switch between growing and shrinking phases in this region.^[30] Tubulin dimers can bind two molecules of GTP, one of which can be hydrolyzed subsequent to assembly. During polymerization, the tubulin dimers are in the GTP-bound state.^[12] The GTP bound to α-tubulin is stable and it plays a structural function in this bound state. However, the GTP bound to β-tubulin may be hydrolyzed to GDP shortly after assembly. The assembly properties of GDP-tubulin are different from those of GTP-tubulin, as GDP-tubulin is more prone to depolymerization.^[31] A GDP-bound tubulin subunit at the tip of a microtubule will tend to fall off, although a GDP-bound tubulin in the middle of a microtubule cannot spontaneously pop out of the polymer. Since tubulin adds onto the end of the microtubule in the GTP-bound state, a cap of GTP-bound tubulin is proposed to exist at the tip of the microtubule, protecting it from disassembly. When hydrolysis catches up to the tip of the microtubule, it begins a rapid depolymerization and shrinkage. This switch from growth to shrinking is called a catastrophe. GTP-bound tubulin can begin adding to the tip of the microtubule again, providing a new cap and protecting the microtubule from shrinking. This is referred to as «rescue».^[32]

«Search and capture» model[edit]

In 1986, Marc Kirschner and Tim Mitchison proposed that microtubules use their dynamic properties of growth and shrinkage at their plus ends to probe the three dimensional space of the cell. Plus ends that encounter kinetochores or sites of polarity become captured and no longer display growth or shrinkage. In contrast to normal dynamic microtubules, which have a half-life of 5–10 minutes, the captured microtubules can last for hours. This idea is commonly known as the «search and capture» model.^[33] Indeed, work since then has largely validated this idea. At the kinetochore, a variety of complexes have been shown to capture microtubule (+)-ends.^[34] Moreover, a (+)-end capping activity for interphase microtubules has also been described.^[35] This later activity is mediated by formins,^[36] the adenomatous polyposis coli protein, and EB1,^[37] a protein that tracks along the growing plus ends of microtubules.

Regulation of microtubule dynamics[edit]

Post-translational modifications[edit]

Although most microtubules have a half-life of 5–10 minutes, certain microtubules can remain stable for hours.^[35] These stabilized microtubules accumulate post-translational modifications on their tubulin subunits by the action of microtubule-bound enzymes.^[38][39] However, once the microtubule depolymerizes, most of these modifications are rapidly reversed by soluble enzymes. Since most modification reactions are slow while their reverse reactions are rapid, modified tubulin is only detected on long-lived stable microtubules. Most of these modifications occur on the C-terminal region of alpha-tubulin. This region, which is rich in negatively charged glutamate, forms relatively unstructured tails that project out from the microtubule and form contacts with motors. Thus, it is believed that tubulin modifications regulate the interaction of motors with the microtubule. Since these stable modified microtubules are typically oriented towards the site of cell polarity in interphase cells, this subset of modified microtubules provide a specialized route that helps deliver vesicles to these polarized zones. These modifications include:

• Detyrosination: the removal of the C-terminal tyrosine from alpha-tubulin. This reaction exposes a glutamate at the new C-terminus. As a result, microtubules that accumulate this modification are often referred to as Glu-microtubules. Although the tubulin carboxypeptidase has yet to be identified, the tubulin—tyrosine ligase (TTL) is known.^[40]
• Delta2: the removal of the last two residues from the C-terminus of alpha-tubulin.^[41] Unlike detyrosination, this reaction is thought to be irreversible and has only been documented in neurons.
• Acetylation: the addition of an acetyl group to lysine 40 of alpha-tubulin. This modification occurs on a lysine that is accessible only from the inside of the microtubule, and it remains unclear how enzymes access the lysine residue. The nature of the tubulin acetyltransferase remains controversial, but it has been found that in mammals the major acetyltransferase is ATAT1.^[42] however, the reverse reaction is known to be catalyzed by HDAC6.^[43]
• Polyglutamylation: the addition of a glutamate polymer (typically 4-6 residues long^[44]) to the gamma-carboxyl group of any one of five glutamates found near the end of alpha-tubulin. Enzymes related to TTL add the initial branching glutamate (TTL4,5 and 7), while other enzymes that belong to the same family lengthen the polyglutamate chain (TTL6,11 and 13).^[39]
• Polyglycylation: the addition of a glycine polymer (2-10 residues long) to the gamma-carboxyl group of any one of five glutamates found near the end of beta-tubulin. TTL3 and 8 add the initial branching glycine, while TTL10 lengthens the polyglycine chain.^[39]

Tubulin is also known to be phosphorylated, ubiquitinated, sumoylated, and palmitoylated.^[38]

Tubulin-binding drugs and chemical effects[edit]

A wide variety of drugs are able to bind to tubulin and modify its assembly properties. These drugs can have an effect at intracellular concentrations much lower than that of tubulin. This interference with microtubule dynamics can have the effect of stopping a cell’s cell cycle and can lead to programmed cell death or apoptosis. However, there are data to suggest that interference of microtubule dynamics is insufficient to block the cells undergoing mitosis.^[45] These studies have demonstrated that suppression of dynamics occurs at concentrations lower than those needed to block mitosis. Suppression of microtubule dynamics by tubulin mutations or by drug treatment have been shown to inhibit cell migration.^[46] Both microtubule stabilizers and destabilizers can suppress microtubule dynamics.

The drugs that can alter microtubule dynamics include:

• The cancer-fighting taxane class of drugs (paclitaxel (taxol) and docetaxel) block dynamic instability by stabilizing GDP-bound tubulin in the microtubule. Thus, even when hydrolysis of GTP reaches the tip of the microtubule, there is no depolymerization and the microtubule does not shrink back.

Taxanes (alone or in combination with platinum derivatives (carboplatine) or gemcitabine) are used against breast and gynecological malignancies, squamous-cell carcinomas (head-and-neck cancers, some lung cancers), etc.

• The epothilones, e.g. Ixabepilone, work in a similar way to the taxanes.
• Vinorelbine, Nocodazole, vincristine, and colchicine have the opposite effect, blocking the polymerization of tubulin into microtubules.
• Eribulin binds to the (+) growing end of the microtubules. Eribulin exerts its anticancer effects by triggering apoptosis of cancer cells following prolonged and irreversible mitotic blockade.

Expression of β3-tubulin has been reported to alter cellular responses to drug-induced suppression of microtubule dynamics. In general the dynamics are normally suppressed by low, subtoxic concentrations of microtubule drugs that also inhibit cell migration. However, incorporating β3-tubulin into microtubules increases the concentration of drug that is needed to suppress dynamics and inhibit cell migration. Thus, tumors that express β3-tubulin are not only resistant to the cytotoxic effects of microtubule targeted drugs, but also to their ability to suppress tumor metastasis.^[47] Moreover, expression of β3-tubulin also counteracts the ability of these drugs to inhibit angiogenesis which is normally another important facet of their action.^[48]

Microtubule polymers are extremely sensitive to various environmental effects. Very low levels of free calcium can destabilize microtubules and this prevented early researchers from studying the polymer in vitro.^[12] Cold temperatures also cause rapid depolymerization of microtubules. In contrast, heavy water promotes microtubule polymer stability.^[49]

Proteins that interact with microtubules[edit]

Microtubule-associated proteins (MAPs)[edit]

MAPs have been shown to play a crucial role in the regulation of microtubule dynamics in-vivo. The rates of microtubule polymerization, depolymerization, and catastrophe vary depending on which microtubule-associated proteins (MAPs) are present. The originally identified MAPs from brain tissue can be classified into two groups based on their molecular weight. This first class comprises MAPs with a molecular weight below 55-62 kDa, and are called τ (tau) proteins. In-vitro, tau proteins have been shown to directly bind microtubules, promote nucleation and prevent disassembly, and to induce the formation of parallel arrays.^[50] Additionally, tau proteins have also been shown to stabilize microtubules in axons and have been implicated in Alzheimer’s disease.^[51] The second class is composed of MAPs with a molecular weight of 200-1000 kDa, of which there are four known types: MAP-1, MAP-2, MAP-3 and MAP-4. MAP-1 proteins consists of a set of three different proteins: A, B and C. The C protein plays an important role in the retrograde transport of vesicles and is also known as cytoplasmic dynein. MAP-2 proteins are located in the dendrites and in the body of neurons, where they bind with other cytoskeletal filaments. The MAP-4 proteins are found in the majority of cells and stabilize microtubules. In addition to MAPs that have a stabilizing effect on microtubule structure, other MAPs can have a destabilizing effect either by cleaving or by inducing depolymerization of microtubules. Three proteins called katanin, spastin, and fidgetin have been observed to regulate the number and length of microtubules via their destabilizing activities. Furthermore, KIAA1211L is predicted to be localized to the microtubules.^[52]

MAPs are determinants of different cytoskeletal forms of axons and dendrites, with microtubules being farther apart in the dendrites ^[53]

Plus-end tracking proteins (+TIPs)[edit]

Plus end tracking proteins are MAP proteins which bind to the tips of growing microtubules and play an important role in regulating microtubule dynamics. For example, +TIPs have been observed to participate in the interactions of microtubules with chromosomes during mitosis. The first MAP to be identified as a +TIP was CLIP170 (cytoplasmic linker protein), which has been shown to play a role in microtubule depolymerization rescue events. Additional examples of +TIPs include EB1, EB2, EB3, p150Glued, Dynamitin, Lis1, CLIP115, CLASP1, and CLASP2.^{[citation needed]}

Motor proteins[edit]

Microtubules can act as substrates for motor proteins that are involved in important cellular functions such as vesicle trafficking and cell division. Unlike other microtubule-associated proteins, motor proteins utilize the energy from ATP hydrolysis to generate mechanical work that moves the protein along the substrate. The major motor proteins that interact with microtubules are kinesin, which usually moves toward the (+) end of the microtubule, and dynein, which moves toward the (−) end.

• Dynein is composed of two identical heavy chains, which make up two large globular head domains, and a variable number of intermediate and light chains. Dynein-mediated transport takes place from the (+) end towards the (-) end of the microtubule. ATP hydrolysis occurs in the globular head domains, which share similarities with the AAA+ (ATPase associated with various cellular activities) protein family. ATP hydrolysis in these domains is coupled to movement along the microtubule via the microtubule-binding domains. Dynein transports vesicles and organelles throughout the cytoplasm. In order to do this, dynein molecules bind organelle membranes via a protein complex that contains a number of elements including dynactin.
• Kinesin has a similar structure to dynein. Kinesin is involved in the transport of a variety of intracellular cargoes, including vesicles, organelles, protein complexes, and mRNAs toward the microtubule’s (+) end.^[54]

Some viruses (including retroviruses, herpesviruses, parvoviruses, and adenoviruses) that require access to the nucleus to replicate their genomes attach to motor proteins.

Mitosis[edit]

Centrosomes[edit]

The centrosome is the main MTOC (microtubule organizing center) of the cell during mitosis. Each centrosome is made up of two cylinders called centrioles, oriented at right angles to each other. The centriole is formed from 9 main microtubules, each having two partial microtubules attached to it. Each centriole is approximately 400 nm long and around 200 nm in circumference.^[55]

The centrosome is critical to mitosis as most microtubules involved in the process originate from the centrosome. The minus ends of each microtubule begin at the centrosome, while the plus ends radiate out in all directions. Thus the centrosome is also important in maintaining the polarity of microtubules during mitosis.^[56]

Most cells only have one centrosome for most of their cell cycle, however, right before mitosis, the centrosome duplicates, and the cell contains two centrosomes.^[57] Some of the microtubules that radiate from the centrosome grow directly away from the sister centrosome. These microtubules are called astral microtubules. With the help of these astral microtubules the centrosomes move away from each other towards opposite sides of the cell. Once there, other types of microtubules necessary for mitosis, including interpolar microtubules and K-fibers can begin to form.^[58]

A final important note about the centrosomes and microtubules during mitosis is that while the centrosome is the MTOC for the microtubules necessary for mitosis, research has shown that once the microtubules themselves are formed and in the correct place the centrosomes themselves are not needed for mitosis to occur.^[59]

Microtubule subclasses[edit]

Astral microtubules are a subclass of microtubules which only exist during and around mitosis. They originate from the centrosome, but do not interact with the chromosomes, kinetochores, or with the microtubules originating from the other centrosome.^[60] Instead their microtubules radiate towards the cell membrane. Once there they interact with specific motor proteins which create force that pull the microtubules, and thus the entire centrosome towards the cell membrane. As stated above, this helps the centrosomes orient themselves away from each other in the cell. However these astral microtubules do not interact with the mitotic spindle itself. Experiments have shown that without these astral microtubules, the mitotic spindle can form, however its orientation in the cell is not always correct and thus mitosis does not occur as effectively.^[61] Another key function of the astral microtubules is to aid in cytokinesis. Astral microtubules interact with motor proteins at the cell membrane to pull the spindle and the entire cell apart once the chromosomes have been replicated.

Interpolar/Polar microtubules are a class of microtubules which also radiate out from the centrosome during mitosis. These microtubules radiate towards the mitotic spindle, unlike astral microtubules. Interpolar microtubules are both the most abundant and dynamic subclass of microtubules during mitosis. Around 95 percent of microtubules in the mitotic spindle can be characterized as interpolar. Furthermore, the half life of these microtubules is extremely short as it is less than one minute.^[62] Interpolar microtubules that do not attach to the kinetochores can aid in chromosome congregation through lateral interaction with the kinetochores.^[63]

K fibers/Kinetochore microtubules are the third important subclass of mitotic microtubules. These microtubules form direct connections with the kinetochores in the mitotic spindle. Each K fiber is composed of 20–40 parallel microtubules, forming a strong tube which is attached at one end to the centrosome and on the other to the kinetochore, located in the center of each chromosome. Since each centrosome has a K fiber connecting to each pair of chromosomes, the chromosomes become tethered in the middle of the mitotic spindle by the K fibers. K fibers have a much longer half life than interpolar microtubules, at between 4 and 8 minutes.^[64] During the end of mitoses, the microtubules forming each K fiber begin to disassociate, thus shorting the K fibers. As the K fibers shorten the pair chromosomes are pulled apart right before cytokinesis. Previously, some researchers believed that K fibers form at their minus end originating from the centrosome just like other microtubules, however, new research has pointed to a different mechanism. In this new mechanism, the K fibers are initially stabilized at their plus end by the kinetochores and grow out from there. The minus end of these K fibers eventually connect to an existing Interpolar microtubule and are eventually connected to the centrosome in this way.^[65]

Microtubule nuclear in the mitotic spindle[edit]

Most of the microtubules that form the mitotic spindle originate from the centrosome. Originally it was thought that all of these microtubules originated from the centrosome via a method called search and capture, described in more detail in a section above, however new research has shown that there are addition means of microtubule nucleation during mitosis. One of the most important of these additional means of microtubule nucleation is the RAN-GTP pathway. RAN-GTP associates with chromatin during mitosis to create a gradient that allows for local nucleation of microtubules near the chromosomes. Furthermore, a second pathway known as the augmin/HAUS complex (some organisms use the more studied augmin complex, while others such as humans use an analogous complex called HAUS) acts an additional means of microtubule nucleation in the mitotic spindle.^[65]

Functions[edit]

Cell migration[edit]

Microtubule plus ends are often localized to particular structures. In polarized interphase cells, microtubules are disproportionately oriented from the MTOC toward the site of polarity, such as the leading edge of migrating fibroblasts. This configuration is thought to help deliver microtubule-bound vesicles from the Golgi to the site of polarity.

Dynamic instability of microtubules is also required for the migration of most mammalian cells that crawl.^[66] Dynamic microtubules regulate the levels of key G-proteins such as RhoA^[67] and Rac1,^[68] which regulate cell contractility and cell spreading. Dynamic microtubules are also required to trigger focal adhesion disassembly, which is necessary for migration.^[69] It has been found that microtubules act as “struts” that counteract the contractile forces that are needed for trailing edge retraction during cell movement. When microtubules in the trailing edge of cell are dynamic, they are able to remodel to allow retraction. When dynamics are suppressed, microtubules cannot remodel and, therefore, oppose the contractile forces.^[46] The morphology of cells with suppressed microtubule dynamics indicate that cells can extend the front edge (polarized in the direction of movement), but have difficulty retracting their trailing edge.^[70] On the other hand, high drug concentrations, or microtubule mutations that depolymerize the microtubules, can restore cell migration but there is a loss of directionality. It can be concluded that microtubules act both to restrain cell movement and to establish directionality.

Cilia and flagella[edit]

Microtubules have a major structural role in eukaryotic cilia and flagella. Cilia and flagella always extend directly from a MTOC, in this case termed the basal body. The action of the dynein motor proteins on the various microtubule strands that run along a cilium or flagellum allows the organelle to bend and generate force for swimming, moving extracellular material, and other roles. Prokaryotes possess tubulin-like proteins including FtsZ. However, prokaryotic flagella are entirely different in structure from eukaryotic flagella and do not contain microtubule-based structures.

Development[edit]

The cytoskeleton formed by microtubules is essential to the morphogenetic process of an organism’s development. For example, a network of polarized microtubules is required within the oocyte of Drosophila melanogaster during its embryogenesis in order to establish the axis of the egg. Signals sent between the follicular cells and the oocyte (such as factors similar to epidermal growth factor) cause the reorganization of the microtubules so that their (-) ends are located in the lower part of the oocyte, polarizing the structure and leading to the appearance of an anterior-posterior axis.^[71] This involvement in the body’s architecture is also seen in mammals.^[72]

Another area where microtubules are essential is the development of the nervous system in higher vertebrates, where tubulin’s dynamics and those of the associated proteins (such as the microtubule-associated proteins) are finely controlled during the development of the nervous system.^[73]

Gene regulation[edit]

The cellular cytoskeleton is a dynamic system that functions on many different levels: In addition to giving the cell a particular form and supporting the transport of vesicles and organelles, it can also influence gene expression. The signal transduction mechanisms involved in this communication are little understood. However, the relationship between the drug-mediated depolymerization of microtubules, and the specific expression of transcription factors has been described, which has provided information on the differential expression of the genes depending on the presence of these factors.^[74] This communication between the cytoskeleton and the regulation of the cellular response is also related to the action of growth factors: for example, this relation exists for connective tissue growth factor.^[75]

See also[edit]

• Microtentacle
• Orchestrated objective reduction – a hypothesis explaining consciousness

References[edit]

External links[edit]

• MBInfo — Microtubules
• 3D microtubule structures in the EM Data Bank(EMDB)
• Protocols for generating microtubules

Microtubules (MTs) are a protein–polymer that are a fundamental part of the cell cytoskeleton and are involved in many critical cellular processes, such as cell division, maintenance of cell polarity, and cargo transport (Amos & Schlieper, 2005; Desai & Mitchison, 1997; Howard & Hyman, 2003; Lansbergen & Akhmanova, 2006).

From: Methods in Cell Biology, 2013